碱性磷酸酶的活力测定(修改).ppt

问题1：
为何要测定血清中酶的活性？有什么意义？（一）血浆特异酶（二）非血浆特异酶2.代谢酶：（细胞酶）
在细胞内发挥催化功能的酶。正常时这些酶存在于组织细胞中，血浆中酶活性很低。细胞内、外浓度差异悬殊。
当酶来源的组织细胞发生病变，细胞膜通透性增加或细胞坏死时，细胞内酶大量进入血浆，导致血浆酶活性显著增高。其下降的临床意义很少。
这一类酶临床应用较多，如转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶等，它们在肝病、心脏疾病时都可能出现变化。
诊断常用血清酶问题1:为什么要测定碱性磷酸酶的活性？有什么意义？问题2：
如何测定酶活性？酶活性：酶催化某一化学反应的能力

常用单位时间内底物的减少量或产物的生成量（即酶促反应速度）来表示酶活性大小固定时间法：（终点法）
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。
连续监测法：（速率法）
连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。
适用于自动生化分析仪
能动态观测酶促反应进程，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。酶偶联测定法问题3：
在酶促反应进程中，是否任一阶段的酶促反应速度都可以代表酶活性？酶促反应进程曲线问题4：
测酶活性应注意哪些方面？合适的底物与最适底物浓度
底物浓度远远高于酶浓度
理想的缓冲液与最适离子强度
最适温度
最适pH
合适的辅因子、激活剂浓度
合理的测定时间
对于固定时间法，需在酶作用一段时间后，加入合适的终止剂终止酶促反应。
尽量去除各种抑制剂
问题5：
如何表示酶活性大小？酶活性单位目录测定ALP活性的方法主要分为两种

一是测定底物解离下的磷酸根来计算酶活力，如β-甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根的缺点

二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物，这种方法又可分为：
酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定（如本次实验方法）。
生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如对硝基苯磷酸二钠（PNPP）法。
无色的对硝基苯磷酸二钠在ALP的作用下，生成在405nm处有特异吸收的淡黄色对硝基苯酚。通过测定在405nm处吸光度的变化速率来计算ALP的活性。
磷酸苯二钠法（一）器材：5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器，721E分光光度计，1cm比色皿，37℃恒温水浴

（二）试剂：
1、碳酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH10.0)：溶解无水碳酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g。4-氨基安替比林1.5g于蒸馏水800ml中，将此溶液转入1L容量瓶内，加蒸馏水到刻度。棕色瓶中贮存。
2、20mmol/L磷酸苯二钠溶液先将500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结晶水，则应称取2.54g)，冷却后加氯仿2ml防腐，在4℃冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中）

立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。
保持反应时温度是均衡的，37°C
计算临床意义：