细胞培养的个人体会详解演示文稿.ppt

细胞培养的个人体会详解演示文稿优选细胞培养的个人体会内容提要体外培养（invitroculture）：是将活体成分或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
可分为器官培养、组织培养、细胞培养三种类型。
细胞培养分为原代培养和传代培养。
简化环境因素、排除了体内实验时一些复杂的因素的影响，利于应用各种物理、化学和生物等外界因素探索和提示细胞生命活动的规律；
提供了大量生物性状相同的细胞，特别是人的活细胞材料作为研究对象。经济、便利，解决了不能用人做实验的问题。
缺点是无法模拟体内的情况，结果有局限性。CO2培养箱超净工作台

培养瓶、培养管、细胞培养板、蓝盖瓶、吸管；
离心管、细胞冻存管、1ml、5mlEP管；
血细胞计数器；
恒温磁力搅拌器、恒温水浴振荡器；
刀、剪、镊解剖用具，200目不锈钢网；第十页，共三十一页。大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和与血清中浓度相似的营养物质。
选择培养基很重要，不同细胞需要适合的培养基。
常见的培养基有：DMEM、F12、DMEM/F12、1640等。
一般是从牛的血液中提取，含有丰富的营养养物质。
常用的胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS),使用前分装50ml离心管，-20℃保存。注意解冻分装前请混合均匀。
使用时放在4℃冰箱解冻，需1-2天。
血清和基础培养基按一定比例混合，一般配制含10-15%血清的培养基，用于细胞培养。
如取20ml胎牛血清，同时加入180mlDMEM基础培养基，即可配成200ml含10%胎牛的DMEM.
器皿加洗洁精浸泡数小时后，用自来水冲洗9次，然后蒸馏水冲洗3次。
烘干：洗干净后烘干。
包装：用牛皮纸或布包装。
消毒前贴上灭菌条，条上写明日期、物品、所有者。

高压灭菌：包装好的器皿装入高压锅内，121℃，维持30分钟。
灭菌后烘干：高压消毒后器皿会被蒸气打湿，要放入烤箱内烘干备用。
细胞的复苏和冻存
细胞复苏与冻存的原则是“慢冻速融”。
复苏细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5℃～0℃。
冻存细胞时，向培养基中加入保护剂二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，减少细胞冰晶的形成。
1、准备好37℃水浴烧杯。
2、将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入37～40℃水浴中使其在1min内融化。
3、无菌条件下打开冻存管，取细胞悬液至离心管中，补加5mL培养液，1600rpm低速离心5min。
4、去上清，加入新鲜培养液适量，吹打成细胞悬液，转入培养瓶中，置37℃培养。
复苏前，准备好含有5mL培养基的培养瓶，放入37℃培养箱。
1、准备好40℃水浴烧杯。
2、将冻存于液氮中的冻存管取出，还原保存盒放入液氮中。将取出冻存管迅速放入水浴中，迅速摇晃加速其融化，放在水浴中，5min钟内须完成。
3、将冻存管放入15mL离心管（剪去底部的旧离心管）中，1500rpm，离心3min。
4、从离心管中取出冻存管，小心吸去上清，从培养箱中取出培养瓶，加入37℃的培养液1mL，吹打30次，转入培养瓶中，置37℃培养。
1、胰酶消化，加含血清培养基终止，离心。
2、去上清，加入冻存液1.5mL，吹打60次，转入冻存管。
3、冻存管放入4℃30分钟--->-20℃60分钟
--->-80℃16-18小时(或隔夜)--->投入液氮中。
3、或冻存管置于程序降温盒中，放置-80℃，--->投入液氮中。细胞的换液和传代贴壁期:0.5-4h
潜伏期:5-24h
对数生长期:24-96h
停止期（衰老期）:96h以上贴壁生长细胞的换液
细胞铺满瓶底80%，吸除瓶内旧培养液，向瓶内加入少量约1～2mL消化液（一般含胰蛋白酶、EDTA），轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面；
在37℃环境下孵育1-2min，把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大。
加入含血清培养基，终止消化，用弯头吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使之脱落，吹打成细胞悬液。
转入离心管，1000-2000rpm，离心5min。
去上清，加入新鲜培养液适量，吹打成细胞悬液，以1：2或1：3的比例接种在新的培养瓶内，置37℃培养。
细胞铺满瓶底约80%，吸除旧培养液，向瓶内加入600uL胰酶，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍细胞表面；
吸除胰酶，在培养箱中孵育1-2min，把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大。
加入新鲜培养液2mL，吹打成细胞悬液，以1：2或1：3的比例接种在新的培养瓶内（已预加新鲜培养基3ml)，置37℃培养。
(比标准方法省2步)细节决定成败，要注意的细节很多。
详细的内容可参考“细胞培养无菌技术”PPT、视频。常见细