半枝莲通过线粒体通路诱导小鼠肝癌细胞凋亡-PPT幻灯片.ppt

半枝莲是一种多年生草本植物，在中药中也被称为半枝莲。主要分布在华南地区，已被用作中国和韩国的肺癌，消化系统癌症，肝癌，乳腺癌和绒毛膜上皮瘤的抗肿瘤剂以及抗炎药和利尿剂。来自半枝莲的提取物(ESB)在体外对许多人类癌症（包括白血病，结肠癌，肝癌和皮肤癌）的生长有抑制作用。然而，其抗肿瘤机制仍不清楚。据报道，许多中草药具有抗癌特性，可以诱导细胞凋亡凋亡。现已经解决的三种凋亡途径，包括线粒体途径，死亡受体途径和内质网应激介导的细胞凋亡途径。在大多数生理和病理情况下，线粒体通路启动细胞凋亡。在线粒体启动的途径中，经历渗透性转换的线粒体将线粒体膜间隔的细胞色素C或细胞凋亡诱导因子的细胞凋亡蛋白释放到细胞溶质中。释放的细胞色素C可以激活caspase-9，并且激活的caspase-9反过来切割并激活子caspase-3。caspase-3激活后，caspase-3的某些特异性底物如聚（ADP-核糖）和聚合酶（PARP）被切割，最终导致细胞凋亡。1.实验目的：3.实验方法与结论，补
H22细胞用不同剂量的ESB处理，分别在0,24,48,72和96h后评价H22细胞的生长速度。不同ESB治疗组H22细胞的细胞活力显着高于5-FU治疗组（图1），高剂量ESB明显抑制H22细胞增殖（P<0.05），低剂量ESB不能明显抑制H22细胞增殖（P>0.05）。MTT测定显示高剂量和中等剂量的ESB以时间依赖的方式在体外抑制H22细胞的增殖。形态学凋亡检测透射电子显微镜：用高度剂量的ESB处理粘附的H22细胞48小时。处理的细胞用胰酶消化，并在4℃预冷3％戊二醛固定2小时。载玻片制作部分，用PBS洗涤细胞，在1％的锇酸中固定另外1小时，在丙酮中脱水并包埋在环氧树脂中。用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，置Hitachi-800透射电子显微镜下观察。荧光显微镜：通过离心获得H22细胞，用PBS洗涤并在室温下在1％戊二醛中固定1小时。用PBS洗涤固定的细胞，用200μmol/LHoechst33258染色10分钟。在荧光显微镜上观察用Hoechst33258染色的细胞核的变化。高分辨率透射电子显微镜显示正常的H22细胞是圆形和规则的，在少数肿瘤细胞中具有染色质边缘（图2A）。在高ESB剂量治疗48小时后，部分核膜以尖锐的角度向外突出。H22细胞典型的凋亡形态出现如，在高ESB剂量组（图2B-D）中可以观察到细胞核的色素凝集和碎裂，软骨细胞肿胀，凋亡体形成。A：对照组B：低剂量治疗组C：中剂量治疗组;D：高剂量治疗组细胞周期分析H22细胞以5×105个细胞/孔在6孔板中孵育，用同源药物处理48小时。收集分离和附着的细胞，并在70℃冰冷的乙醇中于-20℃固定过夜。固定后，用PBS洗涤细胞，重悬于含有1mg/mL核糖核酸酶和50μg/mLPI的1mLPBS中，并在37℃下在黑暗中孵育30分钟。将10000个细胞上流式细胞仪分析DNA含量，并用CellQuest获取软件分析细胞周期相分布。通过流式细胞术分析ESB对细胞周期的影响。在高ESB剂量组，细胞百分数在S期显着降低，G1期增加。空白对照组，低，中，高ESB剂量组细胞凋亡率分别为0.51％，1.07％，3.15％，7.83％，差异有统计学意义（P<0.05）。这些结果表明，高ESB剂量可以诱导G0/G1期的细胞周期停滞和H22细胞凋亡。ESB对线粒体膜电位的影响在激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）下用罗丹明123（Rh123）染色检测线粒体跨膜电位（Δψm）。通过胰蛋白酶消化收集约1×106个细胞，用PBS洗涤2次，并在最终浓度为1μL/mL的Rh123中于37℃暗处孵育20分钟，以1000r/min离心5分钟，用培养基洗涤两次，重悬于培养基中，37℃培养在含有CO2的培养箱中培养60分钟。在激光扫描共焦显微镜488nm的激发波长，530nm的发射波长下测定荧光强度。细胞中罗丹明123的荧光强度代表线粒体膜电位。A：对照组B：低ESB剂量组;C：中ESB剂量组;D：高ESB剂量组。荧光强度（FI）表明细胞中线粒体的膜电位Westernblot法分析在4℃下以2000r/min离心10分钟收集H22细胞（2.5×107），用冷PBS（pH7.2）洗涤2次，以2000r/min离心10分钟，使用以牛血清白蛋白为标准的Bio-Rad蛋白测定试剂。通过15％SDS凝胶电泳分离总蛋白（30μg/泳道），转移至0.45μmPVDF膜。将印迹与所需的一级抗体一起在以下稀释度下孵育：caspase-3（1：1000），细胞色素C（1:1500）和β-肌动蛋白（1:1500）。随后，将膜与适当的第二抗体在室温下孵育1小时。如前所述，通过GelDoc2000系统测定分析免疫印迹。线粒体膜电位的降低可能促进细胞色素C的释放，在用小鼠单克隆