RNA干扰载体的构建的实验流程.pdf

RNA干扰载体的构建的实验流程--RNA干扰载体的构建的实验流程RNA干扰载体主要用来研究基因表达调控RNA干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域进行RNA干扰实验首先是构建RNA干扰载体本文以pRI系列载体为例论述了干扰载体的构建的实验流程。产品技术背景pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNAshRNA经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。由于H1启动子对转录产物长度的严格限制基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA可以在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。插入寡核苷酸设计RNA干扰载体的构建的实验流程--RNA干扰载体的构建的实验流程--pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后与载体连接插入载体XhoIBglII位点之间位于载体上H1启动子下游正确的位置上。连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。1.?选择干扰序列在RNA干扰实验中RNA干扰序列的选择会显着影响RNA干扰效果。我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列：推荐长度为19nt采用21nt序列也可以取得良好效果。RNA干扰序列中不包含大于3nt的连续相同碱基。RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。确保RNA干扰序列与其它基因没有较高的同源性。方向：在编码mRNA的正义链上选择RNA干扰序列。RNA干扰载体的构建的实验流程--RNA干扰载体的构建的实验流程--设计RNA干扰序列是RNAi实验的关键。这里提供的设计原则可以为您设计RNA干扰序列提供帮助。但是值得注意的是遵循这些原则不能确保设计的RNA干扰序列对目标基因有好的抑制效果。针对一个目标基因我们建议您至少设计3条干扰序列并且从中筛选出干扰效果好的序列。2.?寡核苷酸设计。（1）设计正义寡核苷酸链(5’-3’方向)。a)5’TCGACCCb)19nt干扰序列正向序列(与目标mRNA一致)。c)TTCAAGAGA(环状结构)。d)19nt干扰序列的反向互补序列。e)TTTTT。（2）设计反义寡核苷酸链(5’-3’方向)。a)去掉正义链寡核苷酸中5’TCGAb)将步骤a)中得到的序列做反向互补。c)在步骤b)中得到的序列的5’端加上碱基GATC。一个设计好的例子见下图：RNA干扰载体的构建的实验流程--