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原子力显微镜细胞分析.pdf

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原子力显微镜在细胞生物学领域的应用 材料科学与工程学院5120519012蒋沐阳 摘要原子力显微镜是近年来生物领域的重要观测工具，它优良的观测性能和强大清晰 的观测分辨率能够满足细胞生物领域不同的观测需求。本文将阐述原子力显微镜在细胞观 测中的工作原理，以及待观测细胞需要经过怎样的固定处理。另外本文也将展现原子力显 微镜在分析细胞的生命历程以及细胞、分子间的各种相互作用力的性能。 关键字原子力显微镜，细胞生物，成像分辨率，力-距离曲线 前言 几百年来，人类为了观察微小物体创造出了一代又一代显微镜，从最原始的光学显微 镜，到以电子显微镜（SEM）为代表的第二代显微镜，再到以扫描隧道显微镜（TEM）为代 表的新型显微技术，都显示出了各自代表时代科学家的智慧。而在1986年，作为扫描隧道 显微镜的改进产品，原子力显微镜（AFM）的出现，更是突出的显现了显微观测技术作为人 类视觉感官功能的延伸与增强的重要性。[1]不同于扫描隧道显微镜只能应用于导电物体表 面，原子力显微镜在非导电物质的观测上效果出色，并且具有高分辨、制样简单、操作易 行的特点。它在纳米尺度上的成像分辨率极佳，横向达到0.1~0.2nm，纵向则高达 0.01nm，[2]这样的性能使得前几代显微镜望尘莫及，也极大地推动了纳米科学的发展。因 为原子力显微镜在观测过程中能够保持样品的自然状态，防止其发生变形或变性，并且能 够实现对生物样品的连续动态分析与成像，所以它的出现对于微观分析要求极高的生命科 学领域无疑是一块大大的宝藏，发明至今，原子力显微镜已经帮助科学家们在细胞生物学 领域取得了长足的进步。 1原子力显微镜原理简介 简单地说，原子力显微镜（AtomicForceMicroscopy）是通过控制并检测样品与显微 镜配备的针尖间的相互作用力来实现高分辨成像的。[2]它将扫描的针尖制作在一个对微弱 力极为敏感的V字型的微悬臂上，微悬臂的另一端固定住，使得针尖趋近样品并与样品表 面轻轻接触。通过压电陶瓷管的伸缩可以控制原子间的作用力恒定，微悬臂由此可以随着 样品表面的起伏而震动，通过光学检测方法可以得到样品形貌的信息。 2原子力显微镜在细胞表面成像手段 原子力显微镜有三种工作方式：接触式（ContactMode），非接触式（Non-Contact Mode）和轻敲式（TappingMode）。[3]在接触式状态下，针尖与样品的距离始终保持在零 点几纳米的斥力区域，正因为这样的距离接近接触，所以能够得到非常稳定、高分辨的图 像；而在非接触式状态下，针尖与样品的距离则大大远于接触式，主要检测原子间的范德 华力和静电力等长程力，对样品无破坏作用，但是分辨率也比接触式低；介于两者之间的 是轻敲模式。在轻敲模式下，针尖与样品有一个间断的接触，微悬臂的振动可以保证测量 的准确性。因为针尖同样品有接触，所以得到的分辨率几乎接近于接触式，而又因为接触 非常短暂，所以不大会破坏样品表面，特别适宜于分析柔软、粘性和脆性的样品，在液体 中的成像表现也良好。综合上述分析，原子力显微镜在细胞表面的成像往往采用轻敲模 式。 在进行细胞样品观测前，为了简化观测过程，通常需要细胞固定。最常用，也最简单 的的固定法是自然干燥法，但经过此法处理的细胞与活细胞相差甚大。在经过溶液中的细 胞固定方法研究后，研究者们研究出了一套在溶液状态下通过静电作用固定样品的方法。 此方法对基底表面进行聚赖氨酸修饰，利用聚赖氨酸与细胞间的静电相互作用来固定细 胞。虽然此法简单且重复性好，但还是对细胞结构有一定影响。[1]而就在最近，Lu研究 小组[4]使用琼脂糖凝胶极大地改进了溶液中细胞固定的方法，对细胞几乎没有损伤，完成 了更好维持细胞原始状态的目标。 一般来说，使用传统固定方法的AFM表面细胞成像样品的制备过程大致如下：先选取 组织表面较平整的部位。剪成0.5*0.5cm的小块，展平后贴在盖玻片上；然后滴加固定液 在样品表面上（若使用上段介绍的溶液固定法则步骤更为复杂，此处不做赘述），静置30 分钟左右；接着用三蒸水冲洗掉固定液溶质形成的结晶；最后直接将盖玻片置于AFM的扫 描器上，进行成像观测。[2]在图一中显示的就是一例使用自然干燥固定样品的原子力显微 镜细胞成像。[5]此图中，Lister等人采用自然干燥法对耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）进行了原子力显微镜的成像，得到了高分辨的细菌表面形貌图，观察到了细 菌表面压缩的六边形中间层（Hexagonallypackedintermediate，HPI）。 图一细菌HPI层的两个高分辨的原子力显微镜的图像 3原子力显微镜在细胞以及生物大分子成像上的深入研究范畴及实例 应用原子力显微镜观测细胞有着如下的优点：它能够近乎真实又清