蛋白质翻译后修饰的鉴定ppt课件.ppt

第六章蛋白质翻译后修饰的鉴定蛋白质翻译后修饰泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫应答和应激反应等生理过程起着重要作用
磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程
糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用
脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用
组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关
第一节蛋白质翻译后修饰的鉴定5蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用
在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点
胞内信使，cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油）
蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶“活性”
对外界信号具有级联放大作用
蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应磷酸化类型
丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化
精氨酸、组氨酸和赖氨酸的亚酰胺化，天冬氨酸和谷氨酸的酰化
丝氨酸磷酸化：苏氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化=1800：200：1被磷酸化修饰的蛋白
改变所带的电荷
改变催化基团的性质
改变蛋白质的构象
改变蛋白质的亚细胞分步
蛋白质功能变化的多样性蛋白质磷酸化研究有三个主要目的
(1)对位于某一特定状态下细胞内的给定蛋白质在体内的磷酸化氨基酸残基定位
(2)鉴定与磷酸化过程有关的激酶
(3)分析所观察到的磷酸化现象对功能的影响二、磷酸化蛋白质分析的概述二、磷酸化蛋白质分析的概述二、磷酸化蛋白质分析的概述三、磷酸化蛋白质的检测1、32P放射性标记法局限性
磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质
不能标记组织样本
放射性污染2、抗体免疫印迹检测法样品制备（细胞、组织、体液提取蛋白质）四、蛋白质磷酸化位点的分析1、磷酸肽的分离和富集免疫沉淀原理固相金属亲和色谱
Immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC
IMAC柱：金属离子、螯合剂、填料
原理：带正电的金属离子，如Fe3+、Ca3+、Cu2+可以与带负电的磷酸集团产生静电交互作用而结合，这种结合能力受pH值、离子强度和溶液有机相的影响，在高pH或磷酸盐存在的缓冲液中，金属离子与磷酸基团间的结合被破环，磷酸肽被释放出来局限性
丢失低丰度、没有结合到IMAC柱上的磷酸化肽段
具有多磷酸化位点的肽由于较强的亲和力较难被洗脱下来
酸性基团（天冬氨酸、谷氨酸）、电子供体（组氨酸）也会结合到柱上，造成非磷酸化肽的污染
效果：依赖于所选择的金属离子、填充柱的材料及洗脱程序金属氧化物/氢氧化物亲和色谱
Metaloxide/hydroxideaffinitychromatography,MOAC
TiO2、Al(OH)3、ZrO2
TiO2富集磷酸肽原理：
TiO2是一种两性物质，由于钛原子和氧原子的原子表面化合价不饱和，TiO2在不同的pH值下可以表现为路易斯酸或路易斯碱
在酸性溶液中，钛原子带正电表现为路易斯酸，可以与阴离子结合。磷酸盐、硼酸盐、硫酸盐都与TiO2具有高度的亲和力，其中TiO2与磷酸盐的结合能力最高
调节pH值后，TiO2可用于富集磷酸肽离子交换和等电聚焦
离子交换（strongaionexchange,SAX/strongcaionexchange,SCX）:离子强度不同进行分离
IEF:等电点不同进行分离
主要用于复杂样本的预分离，降低样本复杂程度
结合金属亲和等其他富集技术，可取得很好的效果2、磷酸肽的识别MALDI-TOFMS
可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质，与磷酸酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点
原理：
磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化，MALDI-TOFMS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点原理PSD-MALDI-MS分析图利用MALDI-TOF/TOF谱图鉴定磷酸化肽段
a:酶切产物的一级质谱图。磷酸化肽段的质谱峰用星号标出,其相对未磷酸化肽段的理论分子量位移80Da(HPO3=80Da);b:a中标记星号的质谱峰的二级质谱分析。在图中可见比母离子小98Da(H3PO4=98Da)的中性缺失峰串联质谱(MS/MS)
前体离子扫描
通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在；磷酸化肽经CID（碰撞诱导解离）后会产生磷酸基团的特异性片段，这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子”
前体离子扫描前体离子扫描中性丢失扫描中性丢失扫描3、磷酸化氨基酸位点的确定第二种方法基于肽段增加的磷酸酯基团的质量数
如果蛋白是已知的，可通过质量数来确定肽段
在某些情况下，肽段只含有一个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，则很容易找到磷酸化位点，但在大多数情况下肽段含有许多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，则确定磷酸化位点发生困难五、蛋白质磷酸化的定量分析一种基于稳定同位素标记的分析技术SILA