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代谢工程改造酿酒酵母合成植物萜类D-柠檬烯的策略
植物萜类化合物具有广泛的生物活性和药用价值，因此在各种领域，如食品、化妆品和医药等方面应用广泛。D-柠檬烯是一种重要的植物萜类化合物，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤和抗炎作用，因此在医药和保健品领域具有巨大的应用前景。但是目前工业生产D-柠檬烯仍然存在很多难题，如来源有限、提取和纯化难度大等等。因此，开发一种可靠的生物合成路线来生产D-柠檬烯是十分有必要的。
酿酒酵母是一种广泛应用于食品工业的微生物，具有广阔的代谢途径和转化能力。因此，利用酿酒酵母来生产D-柠檬烯的代谢工程研究引起了越来越多的关注。本文将简要讨论代谢工程改造酿酒酵母合成植物萜类D-柠檬烯的策略。
一、基因克隆与表达
1.酿酒酵母中目标基因
在构建酿酒酵母合成D-柠檬烯的代谢工程中，需要通过基因克隆技术将合成D-柠檬烯所需的基因导入到酿酒酵母中。目前在植物中发现了许多参与萜类化合物合成的基因，如MEP途径基因、MVA途径基因和其它配体和受体等。其中，DXS（1-脱氧-D-吡哆醛合成酶）和DXR（1-脱氧-D-吡哆醛还原酶）是MEP（2-甲基-D-吡咯烷磷酸）途径中两个非常重要的基因，它们参与了萜类类化合物生物合成的前五步反应，是生物合成D-柠檬烯的必要条件。
2.选择合适的载体和启动子
选择合适的载体和启动子用于目标基因的表达也是代谢工程改造的关键。在酿酒酵母中，表达异源蛋白时常用的载体有pYES、pGAP和pADH等。其中pYES是最常用的表达载体，因为可以在能量和炭源限制的条件下启动目标基因的表达，从而最大限度地提高蛋白的表达水平。此外，也需选择适当的启动子，以实现稳定和高表达目标基因的目的。
二、途径及酶的调控
1.使用反义基因技术调控关键酶
影响生物合成D-柠檬烯的关键酶在途径中有多个，其中，DXS和DXR在生物合成D-柠檬烯过程中具有重要的作用。因此，在代谢工程改造酿酒酵母合成D-柠檬烯时，可以采用反义基因技术对这些关键酶进行调控。
2.CRISPR/Cas9基因编辑技术
CRISPR/Cas9是近年来发展的一种新型基因编辑技术，可用于定点编辑基因组。在酿酒酵母中，也可用CRISPR/Cas9技术实现基因组的编辑，从而使酿酒酵母具有合成新代谢产物的能力。
三、代谢通路优化
1.选择适宜营养环境
适宜的营养环境对生物合成D-柠檬烯非常重要。通过调整途径中基因的表达和代谢通路中物质的供应，可以实现D-柠檬烯的高产。
2.调整细胞能量代谢
酿酒酵母中能量代谢对代谢通路的运转有着至关重要的作用。因此，通过对酿酒酵母能量代谢环节的调整，可以提高D-柠檬烯的生产量。
结论
代谢工程改造酿酒酵母合成植物萜类D-柠檬烯是一项很有前途的研究领域。在以往的研究模型的基础上，需要持续不断地进行新的创新和尝试，以最大限度地实现酿酒酵母合成D-柠檬烯的效能。通过基因克隆与表达、途径及酶的调控以及代谢通路优化等手段，可以实现酿酒酵母高效生产D-柠檬烯，从而获得更好的经济效益和应用前景。