一种简便快速提取细菌质粒的方法改进.docx

一种简便快速提取细菌质粒的方法改进【关键词】质粒；提取；细菌［摘要］介绍一种简便快速提取细菌质粒的改进方法不需要按常规对细菌培养物离心和用溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ处理而是直接用酚-氯仿(1∶1)处理离心分层取上清异丙醇沉淀所得质粒产量高纯度足以用于酶切。［关键词］质粒；提取；细菌ASimpleandRapidMethodtoIsolatePlasmidAbstract:Asimpleandrapidmethodtoisolateplasmidfrombacteriaisintroduced．BacteriaculturewastreatedbyPhenol-CHCl3(1∶1)upperaqueousphasewaswithdrawnandplasmidDNAwasprecipitatedbyisopropanol．TheroutinestepssuchascollectingbacteriabycentrifugationandtreatingwithSolutionⅠⅡandⅢwerethusavoided．Theplasmidobtainedwaspureenoughforenzymedigestion．Keywords：Plasmid；Isolation；Bacilus提取质粒可以说是分子生物学和基因工程研究中最基本常用的方法在实践中大多采用碱变性法来提取质粒该方法需要先离心收集细菌而后用溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ依次处理［1］。在筛选阳性重组克隆时往往需要对大量菌落进行培养后提取质粒进行酶切鉴定用该方法还是比较费时费力的。目前已经有不少进口及国产的质粒快速提取试剂盒问世但是它们的基本原理还是碱变性［2］仍然需要对细菌离心而后用变性液、中和液处理等。为此我们经过探索找到一种提取质粒的改进方法即简便快速而且所得质粒产量纯度都很好。原理很简单：酚-氯仿是变性剂可以破坏细菌的细胞壁质粒DNA就释放出来而染色体DNA较大与菌体一起分到下层取出上层水相(质粒DNA在其中)用异丙醇沉淀离心使质粒DNA沉降下来再用TE或H2O溶解质粒DNA沉淀质粒即可用于酶切等分子生物学实验。现报道如下。1材料与方法1．1试剂质粒载体PHB3带有人带3蛋白cDNA氨苄青霉素抗性6．5Kb酶切片段396bp由复旦大学生命科学院院长张志鸿教授提供；菌株DH5a由本室冻存；1Kb和10KbMarkerBamHIEcoRI和RNaseA购自Promega公司；质粒小量抽提试剂盒(上海博光生物科技有限公司)；蛋白胨和酵母提取物(Oxoid公司)；琼脂糖购自Sigma公司。1．2常规方法试剂的配制和使用参照文献［3］；细胞培养参照文献［4］常规37℃饱和湿度和5％CO2。所有培养用器具和细菌培养基均经121℃15磅高压湿性灭菌20min。质粒转化采用TSS法制备和转化感受态细菌［5］。1．3质粒提取分别接种含质粒PHB3的DH5a的细菌于2mlLB培养基中37℃振荡过夜。取出700μl细菌培养到一个1．5mlEp管中再加入700μlTris饱和酚-氯仿(体积比1∶1)混均后12000r离心3min小心取出上层液相(约600μl)到一新Ep管中加入等体积异丙醇混均后12000r离心5min去上清用1ml70%乙醇洗涤沉淀真空或自然干燥后溶于50μl含RNaseA(20μl／ml)的TE中。分光光度计测定质粒DNA的浓度和纯度。1．4酶切鉴定用20μl反应体系分别取5μl如上所提取的质粒PHB3BamHI和EcoRI各1．0U及2μl相应10×buffer剩余体积用ddH2O补齐37℃水浴1．5h后行1％琼脂糖凝胶电泳。2结果和讨论采用以上方法从0．7ml细菌培养物得到4．5μg的PHB3OD260：OD280为1．8说明所提取的质粒浓度和纯度都较好。图1为质粒抽提电泳在6kp处条带清晰可见；图2为质粒PHB3酶切产物电泳在400bp处条带清晰可见。图1质粒PHB3质粒抽体电泳（略）图2质粒PHB3酶切产物电泳（略）我们建立的这种简便快速提取细菌质粒的改进方法给分子生物学研究提供很好的技术手段比如我们要克隆一个基因到一个质粒载体上可以用此方法提取载体酶切后电泳回收纯化与目的基因连接转化再用此方法提取重组质粒进行酶切鉴定筛选出阳性克隆。与常规的碱变性法比较本方法更快15