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罗布麻查尔酮合成酶基因(CHS)克隆及其分子进化研究
罗布麻(Lophophorawilliamsii)是一种生长在美洲的多肉植物，被供应药用和精神活性物质革胡笳(又称为麦巴胺或罗布麻沙司)的花草。革胡笳在心理治疗、药用和仪式用途上具有重要作用，而革胡笳中含有的罗布麻碱就是革胡笳的主要生物活性成分。
罗布麻碱的合成依赖于罗布麻查尔酮合成酶(CHS)。CHS酶也参与类黄酮类物质生物的合成，这类物质被发现在植物中广泛存在。CHS基因的研究对于了解罗布麻产生罗布麻碱的生物合成途径有着重要意义。本文旨在报道罗布麻CHS基因的克隆及其分子进化情况。
实验方法：
样品采集：采集罗布麻植物开花期的根、茎、叶和花，以及其他植物的组织作为对照。
RNA提取：使用RNA提取试剂盒从采集到的样品中提取总RNA。之后使用RNase-FreeDNase在提取的RNA中去除DNA污染。
cDNA合成：使用反转录酶转录反应将RNA转换为cDNA，此过程中选择启动复合物的引物，并在25°C进行反应和10°C进行退火。
PCR扩增：使用反向遗传学方法和DNA聚合酶扩增在RT-PCR反应中扩增CHS基因。
克隆：使用TA克隆方法将PCR扩增的CHS基因序列克隆到pGEM-T载体中。
测序：将克隆的CHS基因序列进行测序，并使用BLAST数据库和其他CHS基因序列进行对比。
分析：使用MEGA软件进行序列分析，包括序列比对、进化树构建以及分子进化分析。考虑到多个序列被整合进入分析。在同一进化小组的序列旁边，选择了10个备选序列。
结果：
从罗布麻的根、茎、叶和花中克隆出了CHS基因序列，并在其他植物的组织中进行了比较。所得结果表明罗布麻中CHS基因序列与其他植物中的CHS基因序列具有高度相似性。
对罗布麻CHS基因序列进行多序列比对和进化树构建发现，罗布麻CHS基因序列在分子进化中位置属于AS分支，并与各类黄酮角色呈现高度亲缘关系。这一结果显示罗布麻与其他植物在类黄酮角色生物合成的进化行程中紧密相关。
讨论：
本研究克隆了罗布麻CHS基因，该基因编码合成罗布麻碱的酶。罗布麻CHS基因序列与其他植物中CHS基因序列具有高度相似性，说明CHS基因在植物体系中存在高度保守性。罗布麻从植物物种角度进行分析，进化树显示罗布麻是在AS分支中，与其他黄酮合成角色高度亲缘关系。同时，我们也观察到靠近罗布麻的物种，如Opuntiaspinosissima同样有类黄酮类物质的生物合成过程。这一结果揭示了罗布麻和该物种之间可能存在相似的基因调控和生物合成过程。本研究对了解罗布麻生物合成途径有着重要意义，对真菌中CHS基因的进化行程也具有一定的指导作用。
结论：
本研究成功克隆出了罗布麻CHS基因，并进行了分子进化分析。所得结果表明罗布麻CHS基因在植物体系中具有高度保守性，在类黄酮生物合成进程中与其他黄酮角色高度相关，也对了解罗布麻产生罗布麻碱的生物合成途径有着重要意义。