常春藤皂苷元—吡嗪类衍生物设计、合成及抗肿瘤活性表征.pptx

常春藤皂苷元—吡嗪类衍生物设计、合成及抗肿瘤活性表征研究背景:常春藤皂苷元是一种齐墩果烷型五环三萜类化合物,广泛分布于威灵仙,金银花,白头翁,续断,预知子等药用植物中。现代研究表明,常春藤皂苷元具有抗肿瘤,抗菌,抗炎,抗抑郁,抗糖尿病以及保肝等多种生物活性。
该化合物并凭借高效低毒的体内体外抗肿瘤活性以及逆转肿瘤细胞耐药等特征逐渐引起了药物研究人员的关注。尽管结构优异,仍存在一些不足,例如生物活性相对较弱,价格昂贵,原料获取困难,溶解性较差,生物利用度低等,这一系列问题限制了常春藤皂苷元的进一步开发与应用。
本课题组前期基于“配伍法则-拼合原理”理论,发现将川芎活性成分川芎嗪(2,3,5,6-四甲基吡嗪)引入齐墩果酸及甘草次酸等齐墩果烷型五环三萜,可改善三萜化合物溶解性,提高抗肿瘤活性。因此,本研究基于结构拼合的研究思路,以中药活性分子常春藤皂苷元为母核,在其结构上引入川芎嗪及类似的吡嗪片段,期望提高常春藤皂苷元的抗肿瘤活性,发现生物活性好,毒副作用小的新型常春藤皂苷元衍生物。
研究内容:本研究拟通过酸裂解常春藤皂苷提取物,基于响应面法确立常春藤皂苷元的制备工艺,获得天然活性分子常春藤皂苷元。以常春藤皂苷元为基本母核,通过酯化反应,氧化反应,自由基取代反应等手段,在常春藤皂苷元C28位羧基处引入吡嗪结构,获得一系列常春藤皂苷元衍生物。
以人肝癌细胞(HepG2),人肺癌细胞(A549)及人乳腺癌细胞(MCF-7)为模型,评价常春藤皂苷元衍生物的体外抗肿瘤效果,以犬肾上皮细胞(MDCK)及大鼠心肌细胞(H9c2)为模型评价常春藤皂苷元衍生物的肾脏及心肌毒性,通过偏最小二乘法聚类分析与细胞毒性数据相结合的方式较为客观直观地评价衍生物构效规律,并初步筛选出较为优势的常春藤皂苷元衍生物,进一步结合Giemsa,DAPI染色观察优势化合物对A549细胞形态的影响,利用流式细胞术及分子对接技术初步考察H9促进A549细胞凋亡,抑制细胞增殖的机制。研究结果:制得常春藤皂苷元原料10g以上,合成新颖的常春藤皂苷元衍生物26个,以上结构均通过1H-NMR、13C-NMR以及HRMS进行了确认。
通过MTT法评价了衍生物的体外抗肿瘤活性,并通过偏最小二乘法聚类分析与细胞毒性数据相结合的方式较为客观直观地评价了药物构效关系,初步筛选出活性优异的常春藤皂苷元衍生物H9,该化合物对HepG2细胞,A549细胞及MCF-7细胞均表现出较好的抑制活性,对A549细胞的IC50值达3.45士0.59μμM,与顺铂(IC50为3.85士0.63μM)类似,呈现出色的抗肿瘤活性,同时该衍生物的肾脏以及心肌毒性低于顺铂,展现出中药天然化合物安全低毒的药用优势。结合Giemsa,DAPI染色以及流式细胞术技术,发现H9能增强A549细胞膜通透性,促进钙离子内流,降低线粒体膜电位诱发A549细胞凋亡,同时将A549细胞有丝分裂阻滞在S期,笔者以PharmMapper为平台对常春藤皂苷元及优势化合物在抗肿瘤方面的作用靶点进行预测,发现原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PIM-1可能是常春藤皂苷元衍生物抗肿瘤作用的靶点,并提出常春藤皂苷元衍生物可能是通过抑制原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PIM-1的活力和表达,促进细胞早期凋亡,抑制肿瘤有丝分裂,从而发挥抗肿瘤作用的猜想。
研究结论:本实验设计并合成了26个结构新颖的常春藤皂苷元衍生物,并对该衍生物进行了体外抗肿瘤活性评价。研究发现,引入吡嗪结构可显著提升常春藤皂苷元的抗肿瘤活性。
构效关系规律表明,对于A549和MCF-7细胞而言,以短碳链子链接常春藤皂苷元C28位与吡嗪结构为佳,其中以两个碳作为链子的化合物表现较为优异,对于HepG2细胞,长链链子表现优异,呈现较为明显的4C>2C>1C的活性规律。C28羧基以及C23羟基的修饰位点差异对抗肿瘤活性的提升存在一定影响,对MCF-7和HepG2细胞而言,较之于C28位,于C23位引入吡嗪结构可能更加有利于提升常春藤皂苷元的抗肿瘤活性。
吡嗪环上的甲基数量以及甲基位点的差异可能对于提高常春藤皂苷元的活性没有明显效应规律。通过体外肿瘤细胞模型评价,我们筛选得得到优势化合物H9,该化合物呈现出色的广谱抗肿瘤活性,对A549细胞的杀伤作用类似于临床药物顺铂,并表现出较低的肾脏及心肌毒性。
通过PharmMapper生物信息平台靶点数据分析,分子对接及分子生物学染色技术分析,我们提出常春藤皂苷元衍生物可能是通过抑制原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PIM-1的活力和表达,增强A549细胞膜通透性,促进钙离子内流,降低线粒体膜电位诱发A549肿瘤细胞凋亡,同时将肿瘤细胞有丝分裂阻滞在S期,从而发挥抗肿瘤作用的机制。