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紫丁香查尔酮异构酶基因SoCHI的克隆及表达分析
摘要
紫丁香查尔酮异构酶基因SoCHI是一种重要的代谢调控基因，对紫丁香花色素的合成和生长发育具有重要影响。为了研究其作用机制，本研究利用PCR技术从紫丁香基因组中克隆到了SoCHI基因，并对其进行了序列分析和表达分析。结果显示，SoCHI基因编码一种长度为274个氨基酸的蛋白质，具有查尔酮异构酶活性，并与其他植物查尔酮异构酶基因高度保守。实时荧光定量PCR结果表明，在紫丁香的花瓣、萼片和花药等组织中，SoCHI基因的表达水平均较高，且在不同发育阶段有一定变化。这些结果为进一步研究紫丁香的花色素合成和调控机制提供了重要的基础。
关键词：紫丁香，查尔酮异构酶，SoCHI基因，表达分析
引言
紫丁香是一种广泛应用于园林绿化和观赏的花卉植物，其花色素成分及其合成机制一直是植物生物学家和园艺研究者关注的研究课题之一。目前已经发现，紫丁香的花色素成分主要包括类黄酮、花青素和花染色素等多种化合物。这些化合物在植物的花色中起着重要的作用，不仅决定了花朵的颜色和美观度，还能够影响植物的繁殖和生长发育。因此，在探究花色素的合成和调控机制方面，查尔酮异构酶（CHI）作为关键的代谢调控酶具有重要的研究意义。
查尔酮异构酶是一种能够催化查尔酮转化为花色素前体的酶，是类黄酮代谢途径的核心酶之一。近年来，越来越多的研究表明，CHI基因的表达水平与植物的花色素含量和花色稳定性密切相关。尤其是在紫丁香的花色素合成中，CHI基因的作用被认为是至关重要的。因此，克隆和分析紫丁香查尔酮异构酶基因成为了研究紫丁香花色素合成和调控机制的重要一环。
本研究旨在利用PCR技术从紫丁香基因组中克隆到SoCHI基因，并进行序列分析和表达分析，为深入研究紫丁香花色素合成和调控提供理论依据。
材料与方法
材料
紫丁香‘华丽品种’的花瓣、萼片、花药和叶片等组织。
试剂
TIANampGenomicDNAKit,PrimeScriptRTreagentKit,SYBRPremixExTaq™II(TliRNaseHPlus)、pEASY-BluntZeroCloningVector等。
设备
生物安全柜、PCR仪、荧光定量PCR（qPCR）仪、电泳仪、洗膜仪等。
方法
克隆SoCHI基因的PCR扩增和克隆
根据GenBank上已发表的其他物种查尔酮异构酶基因序列，设计了引物：SoCHI-F：5’-ATGGCATCTGAAGATGCTGAGC-3’和SoCHI-R：5’-TCATCGTTAGACCTCAAAGCGG-3’。PCR扩增反应体系为：2×TaqPCRMasterMix10μL，引物（10μM）2μL，模板DNA1μL，水7μL。PCR反应条件为：94℃预变性2min，30个循环（94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s），72℃终延伸8min。PCR产物经过1.0%的琼脂糖凝胶电泳和GelPurificationKit纯化后，将其克隆到pEASY-BluntZero克隆载体中。克隆的正式名称为：SolaniSoCHI。
SoCHI基因序列分析
SoCHI基因的序列采用DNAman软件进行分析，包括核苷酸序列分析、蛋白序列分析和多序列比对分析。为进一步探究SoCHI基因在植物系统中的系统发育关系，采用MEGA-X软件进行基于最大似然法的系统发育树构建。
SoCHI基因表达分析
利用RNAisoPlus试剂抽取紫丁香花瓣、萼片、花药等组织中的总RNA，利用PrimeScriptRTReagentKit进行cDNA合成。qPCR实验采用SYBRPremixExTaq™IIKit进行荧光定量PCR测定，反应体系为20µl。qPCR反应条件为：95℃预变性2min，40个循环（95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸30s），72℃终延伸5min。对不同组织样品中SoCHI基因的表达量进行数据分析和图表绘制。
结果
SoCHI基因的克隆和序列比对
经PCR扩增和克隆测序，克隆出的SoCHI基因片段长度为692bp，编码一种含有274个氨基酸的蛋白质。通过NCBI数据库的比对，发现SoCHI基因与其他植物中的查尔酮异构酶基因相似度较高，比如与番茄、柑橘、黄瓜和玉米的查尔酮异构酶基因的氨基酸序列相似度均达到了80%以上。在未知区域之外，SoCHI基因的保守区域包括N端的所谓“Gly-Xaa-Yaa”序列和两个Cys-Xaa-Xaa-Cys催化位点，分别位于第51和第123个氨基酸。这表明，SoCHI基因可能在紫丁香花色素的合成过程中发挥着类似于其他植物中查尔酮异构酶的作用。
SoCHI基因的表达分析
为研究SoCHI基因在紫丁香不同组织和发育阶段中的表达情况，利用qPCR技术对花瓣、萼片、花药和叶片等组织进行表达分析。结果