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枯草芽孢杆菌抑菌活性物质鉴定、抑菌特性及发酵条件优化
摘要
枯草芽孢杆菌是一种重要的益生菌，在食品、药品、微生物制剂等领域具有广泛的应用价值。本研究以枯草芽孢杆菌为对象，通过对其发酵液进行分离纯化，鉴定抑菌活性物质，并对其抑菌特性及发酵条件进行了优化。结果表明，枯草芽孢杆菌发酵液中主要存在一种分子量为15kDa的蛋白抑菌活性物质。该物质具有广谱性抑菌作用，对多种致病菌均有明显的抑制效果，抑菌环直径最大可达20mm。此外，该物质在pH为7.0，温度为40℃，等效体积为10mL/L的条件下具有最佳的抑菌效果。本研究为枯草芽孢杆菌抑菌物质的应用开发提供了科学的基础和参考。
关键词：枯草芽孢杆菌；抑菌物质；分离纯化；抑菌特性；发酵条件。
1.引言
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，是一种常见的芽孢形成革兰氏阳性菌，广泛存在于土壤中和植物表面等环境中。枯草芽孢杆菌不仅具有较强的营养代谢和生产能力，还具有很强的耐受能力和适应性，在食品、药品、饲料、环境保护等领域具有广泛的应用价值。其中，枯草芽孢杆菌作为一种益生菌，在动物肠道中具有调节肠道微生态、促进免疫力和防治疾病等多种生理功能，受到了广泛的关注和研究。
目前，已经证实枯草芽孢杆菌产生的多种代谢产物，如多酚类物质、酶类、氨基酸和多糖等物质具有一定的抑菌活性和保健功效。但是，其抑菌物质的种类和鉴定、发酵条件等方面的研究却相对较少，对于其有效性和应用性的评价还存在一定的局限性。因此，本研究旨在通过分离纯化枯草芽孢杆菌发酵液中的抑菌物质，并对其抑菌特性和发酵条件进行研究，以期为枯草芽孢杆菌的应用开发提供科学的依据。
2.材料与方法
2.1材料
枯草芽孢杆菌(an0045)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、酵母菌(Yeast)和芽胞杆菌(Bacillussp.)等细菌株均来源于菌种库，纯度均达到99%以上。菌株的保存和复原方式参照冷冻保存法和琼脂平板接种法(麦康氏琼脂平板培养基)。
2.2方法
2.2.1枯草芽孢杆菌发酵液的制备
选取一定量的枯草芽孢杆菌菌株，在LB液中进行预培养，然后接种到发酵液中，进行发酵过程。发酵条件为：温度40℃，pH值调节到7.0，在摇床上不断摇动，一直到菌落生长到密度达到OD600=1.8左右，即可收集发酵液进行处理。
2.2.2枯草芽孢杆菌发酵液的分离纯化
将收集到的枯草芽孢杆菌发酵液加入0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.2)，经过4000rpm离心10min，收集上清液。将上清液通过0.22μm的过滤膜过滤后，与DEAE-SepharoseFF阴离子交换树脂柱进行连接。使用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.2)进行梯度洗脱，图谱分析后适量扩大洗脱峰区，收集被纯化的抑菌物质溶液，冻干后储存备用。
2.2.3抑菌活性的测定
采用麦康氏琼脂平板法对枯草芽孢杆菌分离后的发酵液进行抑菌活性测定，包括对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌和芽胞杆菌四种不同细菌基础抑菌能力的测试。具体操作为：分别取不同的浓度的纯化物，均匀的涂布在琼脂平板上，然后接种不同的测试菌株，在37℃下孵育后进行观察和测量抑菌环直径。
2.2.4发酵条件的优化
在测定抑菌物质的抑菌效果后，对引发抑菌物质最佳的发酵条件进行了优化。通过对发酵液生产过程中各项参数的调整，分别测定不同pH值、不同温度、不同进料量等变量对抑菌物质的影响，最终确定最佳的发酵条件参数。
3.结果
3.1枯草芽孢杆菌分离的抑菌物质
通过离心法、过滤法、离子交换法等多个分离纯化方式，得到一个分子量约为15kDa的电泳带，与其相关联的抑菌物质经过测定，具有显著的抗微生物生长作用。
3.2抑菌物质的抑菌特性
采用麦康氏琼脂平板法测定不同浓度的抑菌物质对四种不同的测试菌株分别进行抑菌测试，结果发现，该物质具有明显的抑菌效应，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌和芽胞杆菌等多种致病菌均有不同程度的抑制效果，抑菌环直径最大可达20mm。
3.3发酵条件的优化
通过对在发酵过程中的pH值、温度、进料量等参数进行优化，最终得到不同酸碱度、温度、体积等条件下的抑菌效果，结果表明，在pH为7.0，温度为40℃，等效体积为10mL/L的发酵条件下，该分子量为15kDa的抑菌物质具有最佳的抑菌效果。
4.讨论和结论
本研究以枯草芽孢杆菌为研究对象，分离纯化出一种分子量为15kDa的抑菌活性物质，并对其抑菌特性及发酵条件进行了研究。该物质具有多样性抗菌作用，对多种病原菌具有显著的抑制作用。此外，在优化发酵条件后，维持酸碱度、调整温度等措施的实施，能够显著提高抑菌物质的产量和比活力，并且有利于满足实际生产和应用的需要。
总之，通过对枯草芽孢杆菌发酵液的分离纯化、抑菌物质的