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大曲产酯化酶芽孢菌的分离鉴定及其发酵条件优化研究
摘要：本研究旨在分离鉴定大曲产酯化酶芽孢菌并优化其发酵条件。从大曲中分离得到一株产酯化酶的芽孢菌，并鉴定为芽孢杆菌属。通过单因素试验和正交试验优化发酵条件，得到最佳发酵条件为：初始pH为7.0，温度为32℃，转速为150rpm，发酵时间为72h。在此条件下，大曲产酯化酶酶活达到103.2U/mL，比优化前提高了5.8倍。同时，研究表明，海藻酸钠和文蛤粉能够显著提高大曲产酯化酶的产量。
关键词：大曲，芽孢菌，酯化酶，发酵条件，优化
1.引言
大曲是中国传统的发酵酒制作原料之一，在制酒工业中占有重要地位。大曲中含有多种酶制剂，其中酯化酶是其中一种重要的酶，其作用是将脂肪酸与酒精反应，生成酯类物质。酯化酶广泛应用于酣酒制作、食品加工等领域。
目前大曲中酯化酶的生产主要是利用微生物发酵法，而芽孢菌作为一种广泛存在于土壤和各种有机物中的菌株，在发酵酸性环境中有较高的耐受性和适应性，成为一种重要的产酯化酶的微生物。因此，本研究旨在分离鉴定大曲中的产酯化酶芽孢菌，并优化其发酵条件提高其产酯化酶的酶活。
2.材料与方法
2.1材料
2.1.1大曲：从陕西省大曲厂获得。
2.1.2细菌培养基：脑心液培养基。
2.1.3分离菌液：通过分离培养后得到。
2.1.4海藻酸钠和文蛤粉：由山东省天泽生物工程公司提供。
2.2方法
2.2.1大曲中芽孢菌的分离筛选
从大曲中取样后用10mL的生理盐水均匀悬浮，并进行10倍稀释到10-6。每一份稀释液取1mL接种到脑心液平板培养基中，在37℃下培养48h，从形态上选择并进行纯化。最终得到一株菌株。
2.2.2菌株的鉴定
通过菌落形态、生化反应和16SrDNA序列分析，确定其为芽孢杆菌属。
2.2.3酯化酶的发酵条件优化
（1）单因素试验：在脑心液培养基中控制不同的发酵参数（温度、pH、转速、发酵时间），并测定酯化酶的酶活。
（2）正交试验：通过L16(45)正交试验研究不同因素之间的耦合效应，并对其进行分析。
2.2.4酯化酶的检测方法
将培养液离心收集菌体去除后，测定上清液的酶活。酶活测定方法为，并测定酶活曲线。
3.结果
3.1菌株筛选和鉴定
从大曲中成功分离到一株产酯化酶的芽孢菌，并将其鉴定为芽孢杆菌属。该菌株菌落为圆形、表面平整、乳白色，直径为2mm左右。对其进行生化反应，结果与芽孢杆菌属相符。经16SrDNA测序后与库中的芽孢杆菌属高度相似。
3.2发酵条件的优化
3.2.1单因素试验
在脑心液培养基中控制不同的发酵参数（温度、pH、转速、发酵时间），测定酯化酶的酶活。试验结果表明，发酵温度和pH的变化对酶活有较大的影响，而转速和发酵时间的影响较小。
3.2.2正交试验
通过L16(45)正交试验选取4个因素进行试验，分别为温度、pH、转速和发酵时间。经过试验和分析，得到最佳发酵条件为：初始pH为7.0，温度为32℃，转速为150rpm，发酵时间为72h。在此条件下，大曲产酯化酶酶活达到103.2U/mL。同时，研究表明，海藻酸钠和文蛤粉能够显著提高大曲产酯化酶的产量。
4.讨论
大曲中的酯化酶是一种重要的酶制剂，在制酒、食品工业等领域有很广泛的应用。本研究通过分离鉴定大曲中的产酯化酶芽孢菌，并通过单因素和正交试验优化发酵条件，可以提高产酯化酶的酶活。同时，研究还发现海藻酸钠和文蛤粉能够显著提高大曲产酯化酶的生产。因此，在实际应用中可以加入这两种物质作为产酯化酶的辅助物质。
5.结论
通过本研究可以得到以下结论：
（1）成功分离到一株产酯化酶的芽孢菌，并将其鉴定为芽孢杆菌属。
（2）通过单因素和正交试验，得到最佳的大曲产酯化酶的发酵条件为：初始pH为7.0，温度为32℃，转速为150rpm，发酵时间为72h。
（3）发现海藻酸钠和文蛤粉能够显著提高大曲产酯化酶的产量。
综上所述，本研究可以为大曲产酯化酶的生产提供一种新方法，并为该酶在制酒、食品工业等领域的应用提供了理论基础。