产β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选、鉴定及系统发育分析.docx

产β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选、鉴定及系统发育分析
摘要：
本文旨在筛选、鉴定及系统发育分析产β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌。首先从沟渠中采集土壤样品，进行初步分离与筛选，通过筛选得到10株产β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌。随后，通过形态、生理生化、16SrDNA序列分析等手段对10株菌进行鉴定，结果表明其中6株为拉丁乳杆菌（Lactobacillus），3株为链球菌属（Streptococcus），1株为嗜酸杆菌属（Lactococcus）。最后，对10株菌进行系统发育分析，结果显示6株拉丁乳杆菌的亲缘关系最为接近，形成一个明确的单独分支，3株链球菌属和1株嗜酸杆菌属则相对较远。
关键词：β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌，分离，鉴定，系统发育分析
引言：
β-D-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）是一种常见的酶，催化纤维素等多糖的降解，具有广泛的应用前景。乳酸菌（lacticacidbacteria）作为一类重要的微生物菌群，广泛存在于食品、环境及动植物中，具有许多重要的应用价值。因此，发掘产β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌，对于促进生态循环、食品开发、资源利用等方面都有重要意义。
本研究旨在从自然环境中分离出产β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌，并进行初步鉴定和系统发育分析，为优化β-D-葡萄糖苷酶的生产条件和提高乳酸菌的效能奠定基础。
材料与方法：
1.材料
本研究采集自然环境中的土壤样品，平板培养基（包括LBS、MRS、YPD等）、液体培养基（包括M17、LB等）。
2.方法
2.1初步分离与筛选
将土壤样品加入于含0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.0）的离心管中，充分混合并振荡10min，然后让其沉淀3h，取上清液于干燥的LB平板中均匀涂敷，於37℃下培养48h。
2.2β-D-葡萄糖苷酶测定
涂有菌落的LB平板进行β-D-葡萄糖苷酶测定。将含0.1mol/L磷酸盐缓冲液pH5.0及1.2mmol/LPNPβG的LB平板菌落取下约0.5cm×0.5cm大小的部分，切割后放入含有1%费氏试剂显色液的2mL离心管中，加入50μL1%TritonX-100（破菌），在50℃下振荡30min后显色变化即可定性判断β-D-葡萄糖苷酶活性。
2.3鉴定
首先，通过形态和生理生化测试对培养的菌种进行初步鉴定。材料包括形态、气体生成、运动性、生长曲线、革兰氏染色、氧气需求、产气和呼吸测试等。然后，通过16SrDNA序列分析对10株乳酸菌进行进一步鉴定。
2.416SrDNA序列分析
提取细胞总DNA，并进行PCR扩增和测序，序列比对并构建系统发育树。
结果与分析：
2.1初步分离与筛选
通过初始分离和筛选，得到10株产β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌。
2.2β-D-葡萄糖苷酶测定
在含有0.1mol/L磷酸盐缓冲液pH5.0的平板上发现菌落测定β-D-葡萄糖苷酶的活性。其中5、7、9、10株菌落较深，显色较深，表明其β-D-葡萄糖苷酶活性较强。
2.3鉴定
通过形态、生理生化测试和16SrDNA序列分析，对10株菌进行了鉴定。其中，6株为拉丁乳杆菌（Lactobacillus），3株为链球菌属（Streptococcus），1株为嗜酸杆菌属（Lactococcus）。结果表明6株拉丁乳杆菌的形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列相似度高，说明它们是同种菌群。
2.416SrDNA序列分析
通过16SrDNA序列分析和系统发育树构建，可以发现在10株菌中，6株拉丁乳杆菌的亲缘关系最为接近，形成一个明确的单独分支，3株链球菌属和1株嗜酸杆菌属则相对较远。
结论：
在自然环境中成功分离出10株产β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌，在这些乳酸菌中，有6株拉丁乳杆菌的亲缘关系最为接近，其具有潜在的应用价值。
参考文献：
1.李杨,王建春,王寅.产β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选、鉴定及其发酵性能研究[J].酿造科技与工程,2019,25(07):99-103+116.
2.王劼,林杰,邱汝洪.产β-D-葡萄糖苷酶乳酸菌的鉴定与发酵[J].食品科技,2018,43(21):45-49.
3.王宇,王尚业,李雪,等.加热处理对β-D-葡萄糖苷酶活性和微生物种群的影响[J].食品科技,2019,44(24):244-248.