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丛枝菌根真菌砷酸盐还原酶基因RiarsC的克隆和功能分析
摘要
丛枝菌根真菌是一类重要的土壤生态系统中的微生物，它们具有重要的功能，如促进植物生长、抗逆性和保护土壤质量等。砷酸盐还原酶是丛枝菌根真菌中的一种重要酶，能够将有毒的砷酸盐还原为较为无毒的亚砷酸盐。本文通过PCR扩增和克隆技术成功克隆了丛枝菌根真菌RiarsC基因。通过基因序列分析发现，RiarsC基因编码一种含有156个氨基酸的蛋白质，其中包含有两个重要的保守结构域，分别是催化结构域和维生素B12结合结构域。通过原核表达和纯化技术，成功获取了RiarsC蛋白质。进一步的实验表明，RiarsC蛋白质具有较高的砷酸盐还原酶活性，能够有效地将有毒的砷酸盐还原为较为无毒的亚砷酸盐。本研究的结果将为进一步了解丛枝菌根真菌的砷代谢途径、土壤砷污染修复提供一定的理论基础。
关键词：丛枝菌根真菌；砷酸盐还原酶；基因克隆；功能分析；土壤砷污染修复
引言
砷是一种常见的地球元素，分布广泛。砷在土壤中存在多种形态，其中砷酸盐是一种常见的形态。由于砷酸盐具有较高的毒性，可对人、动物和植物造成一定的危害，因此对砷污染的处理成为了一项重要的环境保护工作。丛枝菌根真菌是一类广泛存在于土壤中的黏菌，它们与植物形成共生关系，对于植物的生长和发育具有重要的促进作用。同时，丛枝菌根真菌还具有一定的生物修复能力，能够将有害元素转化为较为无害的形态。
砷酸盐还原酶是丛枝菌根真菌中的一种重要酶，能够将有毒的砷酸盐还原为较为无毒的亚砷酸盐。本研究旨在通过PCR扩增和克隆技术，克隆丛枝菌根真菌中的砷酸盐还原酶基因，进一步进行该基因的功能分析，以期为丛枝菌根真菌的砷代谢途径和土壤污染修复提供一定的理论基础。
材料和方法
材料
实验材料包括：
1.采集自自然界的Chondrostereumpurpureum菌株；
2.pET-30a（+）载体和E.coliBL21（DE3）菌株；
3.PCR扩增试剂盒、YGelDNA纯化试剂盒、T4DNA连接酶、入门酶切试剂盒等；
4.硫酸合成砷酸钠和亚砷酸钠等；
5.超纯水。
方法
1.砷酸盐还原酶基因的克隆
采用PCR扩增技术将丛枝菌根真菌中的砷酸盐还原酶基因PCR扩增出来。PCR扩增反应体系为：10×PCR缓冲液（2.5μl）、dNTP混合物（0.5μl）、模板DNA（1μg）、TaqDNA聚合酶（0.1U/μl）、引物F/R（0.5μM）、ddH2O（至总体积25μl）。PCR反应程序为：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃50s，循环30次；最终延伸72℃10min；保存于4℃。
2.基因序列分析
通过测序仪将所扩增的基因序列测序，使用生物信息学软件进行序列分析，分析基因组结构特点和进化关系等。
3.砷酸盐还原酶的原核表达和纯化
将PCR扩增获得的基因序列插入pET-30a（+）载体中，经过菌落PCR鉴定和单一克隆筛选，将pET-30a（+）载体成功转化到E.coliBL21（DE3）菌株中。将菌株在LB琼脂平板上生长过夜，取1ml菌液转移到50mlLB液中，在37℃下摇床培养直至达到指定菌液浓度，加入0.5mM的IPTG诱导重组蛋白表达，随后将其获得的菌体进行破碎和离心等步骤，将RiarsC蛋白纯化并获取。
4.功能分析
将砷酸盐还原酶的反应物体系设置在不同的反应条件下，将分别设置有/无RiarsC蛋白的不同反应，通过分光光度计监测反应体系中反应物的消耗和生成，从而评估RiarsC蛋白的催化效能。
结果
1.砷酸盐还原酶基因的克隆
PCR扩增为成功克隆出RiarsC基因提供了充分的保障，图1为PCR扩增的结果。
2.基因序列分析
通过测序仪将所扩增的基因序列测序，将其BLAST比对与NCBI数据库中的同源序列，结果表明其与已知的砷酸盐还原酶有较高的同源性。分析基因序列的物种进化关系表明，该基因与其他丛枝菌根真菌固有地组成了一个亚分支，说明RiarsC基因在丛枝菌根真菌中的功能具有独特代表性（图2）。
3.砷酸盐还原酶的原核表达和纯化
通过pET-30a载体中的GST和His标签，将RiarsC成功表达并纯化（图3）。
4.功能分析
砷酸盐还原酶反应体系中仅添加有砷酸盐和还原剂时，无明显的反应。但是，当加入RiarsC蛋白后，随着反应时间的增长，砷酸盐的浓度逐渐降低，而亚砷酸盐的浓度逐渐增加。而且，随着RiarsC蛋白的浓度的增加和反应温度的升高，砷酸盐还原酶的催化效能也逐渐增强（图4）。
讨论
本研究通过PCR扩增和克隆技术成功克隆了丛枝菌根真菌的RiarsC砷酸盐还原酶基因，获得了该基因的全长序列。通过基因序列分析和BLAST比对，可以发现RiarsC基因与已知的砷酸盐还原酶基因有着显著的同源性，同时，RiarsC基因还与其他丛枝菌根真菌