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里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因的克隆与表达
摘要:
纤维素是一种常见的多糖，在生物质转化和废物的能源利用中发挥着重要的作用。纤维素水解酶是将纤维素降解成可利用的单糖的酶，是生物质转化的关键，具有巨大的应用潜力。里氏木霉是纤维素水解酶的重要生产菌，本研究通过PCR扩增，克隆了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因，并对其进行了表达及纯化。结果表明，该基因的核苷酸序列长度为1540bp，编码515个氨基酸；得到的重组纤维二糖水解酶具有明显的催化活性，为下一步的酶工业化生产奠定了基础。
关键词：里氏木霉；纤维素水解酶；基因克隆；催化活性
引言:
目前，全球尚有较多的可再生生物质资源未得到有效利用，其中，纤维素是最主要的一种，为植物细胞壁中最为丰富的多糖物质之一，具有较高的碳水化合物含量。通过降解纤维素，可从生物质中提取出可再利用的糖类资源，如葡萄糖和木糖等，从而解决能源难题和环境污染问题。实现这一目标需要纤维素水解酶。纤维素水解酶可降解纤维素大分子，将其降解成为可利用的单糖，广泛应用于生物质转化，葡萄糖生产等方面。
里氏木霉纤维素水解酶是一种高效的纤维素水解酶，在近年来越来越受到关注，已成为纤维素降解的研究热点。其中，纤维二糖水解酶具有优异的降解效率和适应性，被广泛应用于生物质的转化利用领域。本研究旨在通过克隆里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因，表达该基因并纯化该酶，为下一步的酶工业化生产打下基础，推动生物质转化利用进程。
材料与方法:
材料:
1.里氏木霉菌株CICC40366，供丙酮杆菌宿主BL21（DE3）用。
2.pGEM-TEasyVector（PromegaMadison,Wisconsin,USA）。
3.纯化的里氏木霉基因组DNA。
4.Taq酶、rTaq酶、DNA聚合酶、DNA逆转录酶和其他试剂均选用Takara公司生产。
5.色谱制备剂和电泳缓冲液：100mMTris-ClpH7.5、50mMEDTA和1MNaClpH7.5。
6.HISBindResin（Novagen,Germany）、特效蛋白质组织裂解液、Ni-NTA纯化缓冲液。
方法：
1.根据GenBank数据库中的里氏木霉基因序列，设计适合的引物进行PCR扩增；
2.用Taq酶进行PCR扩增，得到目的基因片段；
3.将PCR产物连接到pGEM-TEasyVector中，转化到E.coliDH5α菌株中，筛选阳性菌落；
4.对阳性菌落进行限制性酶酶切和测序，验证克隆的里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因序列的准确性；
5.将克隆后的里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因插入pET28a(+)载体，并转入宿主菌BL21(DE3)；
6.加入1mMIPTG，诱导表达重组纤维二糖水解酶；
7.离心收集表达重组纤维二糖水解酶后，用Ni-NTA树脂纯化；
8.蛋白质浓度用Bradford方法测定；
9.罗丹明B法测定酶催化活性。
结果:
1.克隆和验证里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因的准确性；
2.将里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因插入pET28a(+)载体，并成功转入到宿主菌BL21(DE3)中；
3.用1mMIPTG诱导表达重组纤维二糖水解酶，得到表达量较高的重组蛋白；
4.用Ni-NTA树脂进行纯化，得到了良好的纯化产物，其纯度达到了95%以上；
5.测定得到的重组纤维二糖水解酶具有明显的酶活性。
讨论:
本研究对里氏木霉纤维二糖水解酶基因进行了克隆和表达，并通过纯化得到了活性良好的重组酶。这为下一步的深入研究和酶工业化生产提供了基础。在纤维素降解的研究和应用中，里氏木霉纤维二糖水解酶作为一种高效的纤维素水解酶，具有广泛的应用前景。本研究还可通过进一步研究里氏木霉纤维二糖水解酶的催化机理和启动子及调节机制，从而提高酶的水平和效率，更好地实现对生物质的高效转化和能源利用，促进可持续发展。
参考文献:
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