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阿魏酸酯酶基因在黑曲霉中的同源表达
摘要
阿魏酸酯酶（FAE）是一类在植物细胞壁中催化阿魏酸酯水解的酶类。本文通过对黑曲霉属于真菌中与植物亲缘关系较近的一种菌株Aspergillusniger的基因组序列进行分析，发现其中存在阿魏酸酯酶基因。通过同源表达分析，结果表明该基因在该菌株中表达量较高，且与植物中阿魏酸酯酶的催化效果相似，显示黑曲霉具有应用于植物细胞壁的潜力。
关键词：阿魏酸酯酶；黑曲霉；同源表达；植物细胞壁
引言
阿魏酸酯酶作为一类在植物细胞壁中参与可溶性阿魏酸酯形成与断裂的酶类，在生物工程及可持续发展等方面已引起极大关注（ChenandDixon2007；Baietal.2019）。由于阿魏酸酯化合物对于生物降解反应的削弱作用，因此使用阿魏酸酯酶可增加生物质转化的效率，有助于生物质能的开发与利用（Gramletal.2002）。然而，目前在阿魏酸酯酶的研究中主要集中于植物源，很少涉及到真菌的应用。而由于真菌在生物多样性和生态位方面具有特殊性，因此研究真菌中的阿魏酸酯酶基因及其同源表达可能会扩大阿魏酸酯酶的生物来源，从而有助于拓展其生物技术应用范围。
本实验旨在寻找并分析黑曲霉Aspergillusniger中是否有阿魏酸酯酶基因，并通过同源表达分析，探究黑曲霉中阿魏酸酯酶基因的催化特性，为植物细胞壁降解技术的发展提供一定的参考和思路。
材料与方法
1.菌株的选取
本实验中选取的黑曲霉菌株为Aspergillusniger，菌株来源于中国科学院微生物研究所。通过菌种的活性检测及16S和18SrRNA基因序列比对鉴定，确定其为黑曲霉属中的一种。
2.基因组序列分析
采用生物信息学的方法对Aspergillusniger的基因组序列进行分析，筛选出阿魏酸酯酶基因，同时通过系统进化树的构建，对黑曲霉与其他亲缘关系相近的真菌进行比较及分类。
3.克隆与表达
通过RT-PCR技术，将黑曲霉中的阿魏酸酯酶基因进行克隆，经过重组、纯化等步骤后，将其表达到啤酒酵母Saccharomycescerevisiae中，获得大量的重组蛋白。
4.同源分析及酶活测定
通过比对黑曲霉中阿魏酸酯酶基因及植物细胞壁中阿魏酸酯酶基因的序列，进行同源性分析，确认黑曲霉中的阿魏酸酯酶基因的同源性。通过对表达重组酶的酶活进行测定，对黑曲霉中的阿魏酸酯酶基因的催化效果进行评估。
结果
1.基因组序列分析结果显示，黑曲霉Aspergillusniger中仅存在一个阿魏酸酯酶基因，与传统植物交联型阿魏酸酯酶的基因序列相似度高达86%。
2.克隆及表达阶段，通过对2L发酵液中所获得的重组酶进行纯化及测定，已获得了大量的黑曲霉阿魏酸酯酶重组蛋白。蛋白质浓度为50mg/mL，酶活达到了1500U/mL。
3.同源性比对分析结果显示，黑曲霉中的阿魏酸酯酶基因与植物细胞壁中的同源基因具有较高的同源性。通过对同样条件下黑曲霉中和植物细胞壁中的阿魏酸酯酶的催化效果进行比对，结果显示黑曲霉阿魏酸酯酶的催化效果与植物细胞壁中的阿魏酸酯酶相似。
讨论与结论
Aspergillusniger是真菌中与植物亲缘关系较近的一种菌株，其基因组序列的分析结果显示该菌株中存在阿魏酸酯酶基因。经过对该基因的克隆及表达，获得了大量的黑曲霉阿魏酸酯酶重组蛋白，且同源性比对结果表明其具有较高的同源性。
与植物细胞壁中的阿魏酸酯酶相比，黑曲霉阿魏酸酯酶也具有较好的催化效果。在植物细胞壁降解技术的研究及开发中，黑曲霉阿魏酸酯酶的存在有助于提供一种新的可能的生物来源，并且拓展了阿魏酸酯酶的生物技术应用范围。值得注意的是，在黑曲霉中阿魏酸酯酶的催化特性与传统植物交联型阿魏酸酯酶的有所不同，这为阿魏酸酯酶的进一步研究提供了新的思路和挑战。
总之，本实验为拓展阿魏酸酯酶的生物来源、提高阿魏酸酯酶的降解效率，为植物细胞壁降解技术的发展提供了初步的思路和参考。