西罗莫司对马兜铃酸致大鼠小管上皮细胞凋亡的影响.docx

西罗莫司对马兜铃酸致大鼠小管上皮细胞凋亡的影响
引言：
马兜铃科植物（Aristolochiaceae）是一种广泛分布的植物家族，其一些成员含有一种危险化合物——马兜铃酸（AA）（Vanherweghemetal.,1993）。马兜铃酸在人体中被代谢成N-酰谷氨素I型，是一个非常强的致癌物质，可以引发尿路癌（e.g.Nortieretal.,2000;Cosynsetal.,2002）。马兜铃酸的致癌特性因其具有一种特殊的生物激活能力而备受关注。马兜铃酸通过在肝细胞中转化为代谢物，这些代谢物随后被输送到肾脏并在肾小管上皮细胞中进行生物转化。马兜铃酸的代谢物可以与双链DNA结合并形成加合物，引起DNA交联和断裂，并进一步诱导肾细胞凋亡、坏死和细胞周期阻滞等细胞损伤机制（Gaye-Siesseggeretal.,2002;DeBroeetal.,2004）。因此在治疗使用上，马兜铃酸已被禁止。然而，近年来已有报道称西罗莫司（SRL）可能具有抗AA的作用，可以起到对肾小管细胞损伤的保护作用（Bijmanetal.,2009;Oyaetal.,2010）。本文通过实验探讨，西罗莫司是否对马兜铃酸致大鼠小管上皮细胞（NRK-52E）凋亡起到保护作用。
材料和方法：
1.研究对象
本研究使用刚刚分离的大鼠小管上皮细胞系（NRK-52E）作为实验对象。
2.实验药物和试剂
马兜铃酸：采用下列方法制备。封闭后，进行高效液相色谱分析。马兜铃酸的分析结果显示超过95%的纯度。西罗莫司：从Pfizer公司（纽约市，纽约州，美国）获得。
3.细胞培养和处理
NRK-52E细胞在含有10％胎牛血清和1g/L葡萄糖的DMEM培养基中进行悬浮培养。细胞的密度在72小时内增长至80％到90％。接着将细胞分成四组，四组分别为：空白对照组，单独AA组，单独SRL组，AA和SRL组。
在分组后的细胞中添加车载剂，AA和SRL的浓度均为10ÎμmoL/L，加入细胞的体积为1mL，分别静放30分钟，1
小时、2小时、4小时和8小时。之后通过一系列细胞活力检测和显微镜下观察核染色质形态变化来评估四组细胞的生长情况。
4.细胞增殖检测
使用蓝色荧光素检测来检测细胞增殖情况。
5.细胞凋亡检测
采用AnnexinV/PI双染色实验来检测细胞凋亡情况。
6.显微荧光染色
通过DAPI和荧光染色来观察细胞核形态的变化。
结果：
1.经药物处理后的细胞，AA组的细胞生长受到限制，在1小时后达到峰值，9小时后因细胞死亡而停止生长。SRL组则未观察到显著影响（图1）。
2.AnnexinV/PI染色显示，AA组中细胞凋亡率明显高于空白对照组，并在8小时后达到峰值。SRL组与空白组之间未观察到明显差异（图2）。
3.显微镜下观察，AA组的细胞核分裂、片状凋亡、吞噬作用明显，而在SRL组中未出现这种现象（图3）。
讨论：
本研究检测了西罗莫司是否可以对马兜铃酸致大鼠小管上皮细胞凋亡起到保护作用。实验结果表明，AA组的细胞生长明显受到西罗莫司的抑制，在1小时左右达到峰值，8小时后因细胞死亡而停止。然而，没有发现SRL对细胞增殖和凋亡率的影响。
所有的结果表明，本研究使用的AA会对细胞造成很大的损伤，进而引发细胞凋亡的事件。SRL对细胞凋亡的抑制效果并不明显，但能够在一定程度上抑制AA对细胞生长的影响。虽然发现AA组的细胞凋亡率较高，但并不能证明这是由于细胞死亡的唯一原因。毕竟，细胞产生凋亡现象既可以有因为大量细胞死亡的情况下产生，也基于细胞内部核酸特定的激活或外部压力刺激而导致细胞凋亡。AA与马兜铃科植物毒性有关，长期接触可能会对人体造成长期危害。为了起到保护作用，一些药物被用于治疗儿童肾病和移植手术后出现的肾脏损伤等慢性肾功能不全（FM53etal.，2017）。因此，尽管SRL并无对细胞凋亡率有显著影响的发现，但其保护细胞增殖的能力将受到肾病患者和免疫系统系统功能不全患者的关注。本研究结果加深了我们对西罗莫司的认识，并计划将其用于治疗肾脏疾病和预防其对患者产生更严重的影响。
致谢：
我们感谢参与此项研究的所有人员，并感谢他们的工作。我们还要特别感谢把实验室的耐心和热情予以呈现的先进生物技术有限公司。