RNAi-技术原理ppt课件.ppt

RNAi的实验方法目录miRNA的原理miRNA如何行使功能？miRNA途径：
miRNA可以降解mRNA，或者抑制mRNA翻译蛋白质RNAi作用机制RNAi实验
三大基本路线线路一：非哺乳动物细胞体系的RNAi实验和选择（1）构建目的基因载体，选取目的基因的特异性序列（约200bp~300bp），构建到T载体上。
（2）使用5′端连接有T7启动子的引物PCR扩增目的基因，得到两端均连接有T7启动子序列的目的基因片段。
（3）T7RNA聚合酶进行转录。dsRNA、ssRNA、DNA模板。
（4）加入Rnase和Dnase消除ssRNA和DNA模板。
（5）离心纯化dsRNA。

10siRNA导入细胞的方法线路二：哺乳动物细胞RNAi实验：siRNA的设计，合成siRNA的转染siRNA的转染siRNA的转染线路三：shRNA表达载体和病毒载体此法需首先化学合成一段编码siRNA正义和反义链的模板，正义与反义序列之间由一段环(1oop)序列隔开。插入载体PolⅢ启动子下游，然后转入细胞，环序列可使转录出的RNA链折叠成具发夹结构的小RNA分子（shRNA），这些小RNA可被细胞内的Dicer切割为长21bp的siRNA。18RNAi作为一种重要的基因转录后沉默机制，广泛应用于基因功能研究，肿瘤及病毒感染性疾病治疗的实验研究，其核心内容是siRNA能够抑制同源基因的表达。对于siRNA而言，现在颇有争议的地方在于它对靶基因的沉默特异性，主要体现在两个方面：
（1）脱靶效应。
（2）打破内源性miRNA的平衡。脱靶效应降低siRNA脱靶效应（2）对siRNA的化学修饰（3）优化siRNA设计谢谢！