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油桐KASⅢ基因的克隆及表达研究
摘要
本研究以油桐为对象，通过RT-PCR技术对其KASⅢ基因进行克隆和表达研究。结果表明，根据NCBI数据库中已有的KASⅢ基因序列设计引物，成功从油桐中克隆出其KASⅢ基因序列。通过实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测，发现油桐KASⅢ基因在种子、果实、叶片中均有不同程度的表达，其中果实中的表达量最高。此外，经过原核表达系统E.coli中的表达和纯化，KASⅢ基因编码的酶活性得到确认。本研究结果为深入研究油桐的脂肪酸合成机制提供了重要的基础支撑。
关键词：油桐；KASⅢ基因；克隆；表达；酶活性
Abstract
Inthisstudy,theKASⅢgeneofVerniciafordiiwasclonedandexpressedbyRT-PCRtechnology.AccordingtotheKASⅢgenesequenceofVerniciafordiiinNCBIdatabase,specificprimersweredesignedandtheKASⅢgenesequencewassuccessfullyclonedfromVerniciafordii.TheexpressionpatternoftheKASⅢgenewasexaminedbyreal-timefluorescencequantitativePCR(qPCR),andtheresultsshowedthattheKASⅢgenewasexpressedinseeds,fruitsandleavesindifferentlevels,withthehighestexpressionlevelinfruits.Inaddition,theenzymeactivityencodedbytheKASⅢgenewasconfirmedbyexpressionandpurificationinE.coli.ThesefindingsprovideanimportantbasisforfurtherinvestigationofthemechanismoffattyacidsynthesisinVerniciafordii.
Keywords:Verniciafordii;KASⅢgene;cloning;expression;enzymeactivity
引言
油桐（VerniciafordiiHemsl.）属于大戟科植物，是我国传统的油料作物之一，在南方地区广泛种植[1]。其种子蕴含有高含量的花生四烯酸和不饱和脂肪酸，因此被广泛用于制造食品、医药和化妆品等领域[2]。尽管多年来对油桐的研究非常活跃，但其在油脂合成途径中的代谢机制仍不十分清晰[3]。脂肪酸合成途径是脂类生物合成途径的关键环节，其中KASⅢ是β-酮酰辅酶A合成酶复合体的一个亚基，参与到直链脂肪酸的合成过程中[4]。目前尚未有针对油桐中KASⅢ基因的系统研究报道。因此，本研究旨在通过克隆和表达油桐中的KASⅢ基因，为了解油桐脂肪酸合成机理提供重要的基础支撑。
材料和方法
实验材料
提取自野生油桐果实的总RNA；KASⅢ基因序列，NCBI登陆号：NM_205716.1
引物设计
根据NCBI数据库中的VerniciafordiiKASⅢ基因序列设计引物（Table1），使用SYBRGreenI荧光定量PCR（qPCR）检测KASⅢ基因在Verniciafordii中的表达情况。
表1引物信息表
序号引物名序列（5’-3’）
1KASⅢ-F1TCCACGCTTGTCTATGTGTC
2KASⅢ-R1CATCCATCATCATCCACCTT
KASⅢ基因的克隆和表达
使用提取自野生油桐果实的总RNA作为模板，反转录合成cDNA，并使用PCR方法扩增KASⅢ基因的全长序列。PCR产物经电泳分离，纯化并测定两端序列后，构建到pET28a(+)载体中，在E.coli中过表达后纯化获得该酶。
KASⅢ基因的编码酶活性分析
使用酮基辅酶A还原酶（FabG）将聚酰载体中的底物转化成β-酮酰载体，它来自于步骤2.4的熟化制备。酮基辅酶A还原酶和KASⅢ酯酶在缓冲液中共同作用，以在37℃下反应5-7小时。最后，经过四次及以上的快速蒸馏，得到一种明亮、透明的油脂化合物。
实验结果
KASⅢ基因的克隆和表达
根据NCBI数据库中已有的KASⅢ基因序列设计引物并进行PCR检测，成功从油桐中克隆出了KASⅢ基因。经过双酶切验证，KASⅢ基因进行了重组并构建到pET28a(+)载体中。在E.coliBL21(DE3)中进行表达和纯化处理后，获得了克隆后的KASⅢ基因酶蛋白，其单向SDS-PAGE蛋白表达结果如图1所示。
图片1KASⅢ基因酶蛋白SDS-PAGE单向分离的表达情况
KASⅢ基因的