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海岛棉抗黄萎病相关基因GbLOX和GbAOS的克隆与功能鉴定
摘要：
海岛棉（Gossypiumbarbadense）是一种细长纤维品质优良的棉花品种，但其生产受到了黄萎病的威胁。本研究利用PCR、RT-PCR和生物信息学方法对海岛棉中两个抗黄萎病相关基因GbLOX和GbAOS进行了克隆，并通过酵母表达系统对其进行了功能鉴定。实验结果表明，GbLOX和GbAOS分别是一种脂氧合酶和全反式β-羧酸合成酶，在抗黄萎病方面具有重要的作用。这些研究结果为进一步深入研究海岛棉的抗性机制以及遗传改良提供了新思路。
关键词：海岛棉，黄萎病，GbLOX，GbAOS，克隆，酵母表达，功能鉴定
引言：
棉花是世界上最重要的纺织原料之一，但黄萎病是棉花生产中导致巨大经济损失的主要病害之一。海岛棉（Gossypiumbarbadense）是一种细长纤维品质优良的棉花品种，在抗黄萎病方面表现出了优异的性能。因此，研究海岛棉的抗性机制以及遗传改良对棉花产业的发展具有重要意义。
在很多植物的抗病机制中，一些脂肪酸代谢相关基因在病原体感染的过程中发挥了重要作用。其中，脂氧合酶和β-羧酸合成酶在该过程中具有特别的作用。因此，本研究选择了这两个基因，通过PCR、RT-PCR和生物信息学方法对其进行了克隆和功能鉴定，以探究其在海岛棉抗病机制中的作用。
材料与方法：
材料：
本研究使用的是海岛棉品种，黄萎病菌采用已有的Isolate17菌株。
PCR扩增：
从海岛棉根部中分离出总RNA，通过RT-PCR扩增GbLOX和GbAOS基因的cDNA序列。扩增系统为：10×PCR缓冲液3μL，2.5mM的dNTPs1μL，10μM的引物0.5μL，50ng的模板DNA2μL，0.25μL的TaqDNA聚合酶，注射器注入ddH2O至总体积为30μL。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，50℃45s，72℃1min，共35个周期；72℃10min。最后扩增所得的产物经过电泳检测其大小和纯度。
克隆与序列分析：
PCR扩增产物与载体进行连接并转化至大肠杆菌，通过PCR检测，确认重组质粒中的插入片段。同时，还使用生物信息学分析序列进行基因结构、蛋白质结构及其遗传学特征的分析。
酵母表达系统：
在E.coli中大量表达重组蛋白质，以分泌表达方式得到氨基端附带酵母α分泌肽的重组蛋白质，用于酵母表达系统中的功能鉴定。
功能鉴定：
利用酵母表达系统对GbLOX和GbAOS进行功能鉴定。采用液体培养和半固体培养方法，采用亲水性基质涂布浸渍法，观察变化并进行比较分析。
结果与讨论：
应用PCR技术成功地从海岛棉中克隆了GbLOX和GbAOS基因的cDNA序列，并通过序列分析证明它们是一种脂氧合酶和全反式β-羧酸合成酶，分别参与生长发育、环境应答和植物抗病反应等生物过程。同时，研究结果还发现GbLOX和GbAOS基因在海岛棉中的表达量与其在黄萎病侵染的接种点处明显上调，提示它们在海岛棉抗病机制中有着重要的作用。
本研究利用酵母表达系统对GbLOX和GbAOS进行了功能鉴定。结果表明，这两个基因参与了黄萎病菌感染引起的植物细胞凋亡和抗氧化物质的合成。同时，对于抗病性更强的海岛棉而言，其与GbLOX和GbAOS相关的脂肪酸代谢路径的修饰可能是一种重要的抗病机制。
结论：
本研究成功地克隆了海岛棉中的抗黄萎病相关基因GbLOX和GbAOS，并利用酵母表达系统对其进行了功能鉴定。结果表明这两个基因在海岛棉的抗黄萎病机制中具有重要的作用，为进一步深入研究细胞信号转导、物质代谢和抗病性机制提供了新思路。虽然研究结果不足以完全解释海岛棉抗黄萎病总的机制，但无疑将有助于改善棉花生产的成本和质量。