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棉花GhRCA1基因启动子的克隆及功能分析
摘要
棉花(GossypiumhirsutumL.)是重要的经济作物之一。研究其基因启动子对于棉花生长及发育的了解十分重要。本研究利用PCR技术克隆了棉花GhRCA1基因启动子，经过序列分析发现该启动子长度为1748bp。通过构建转录本融合体及荧光质粒分析，得出该启动子可以正常启动绿色荧光蛋白(GFP)的表达。进一步的功效表达分析展示，该启动子对于驱动基因的表达具有较强的稳定性和活力。本研究结果表明，棉花GhRCA1基因启动子对于棉花的物质转运、信号转duction等过程中发挥了积极作用，可为改良棉花产量及发育提供新的思路。
关键词：棉花，基因启动子，克隆，荧光质粒，驱动表达
引言
棉花是世界三大经济作物之一，由于其纤维质地柔软、韧性好，是一种理想的纺织原料。然而，由于环境因素与高病原性引起的棉花病害等多种因素的影响，利用基因工程技术对棉花进行改良是必不可少的。而基因启动子是调控基因转录及表达的重要调节因素，因此，对于棉花基因启动子的研究显得越来越重要。
GhRCA1(Regulatorofchromosomecondensation1incotton)基因是棉花中一个重要的表达基因，在棉花生长发育以及抗病性等方面发挥着重要作用。本研究通过PCR技术克隆了GhRCA1基因启动子，并通过构建转录本融合体及荧光质粒分析该启动子的表达及功能。结果表明，该启动子对于驱动基因表达具有较强的稳定性及活力，可为棉花的改良提供新的思路。
材料与方法
克隆GhRCA1基因启动子
从棉花基因组DNA中，根据GhRCA1基因启动子参考序列，设计PCR引物克隆GhRCA1基因启动子。PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸2min的35个循环，72℃伸长10min的末端循环，反应体系总体积为50μl。PCR产物经1%瓷胶电泳进行分离和获得纯化，然后用T4DNA连接酶进行重组导入质粒pBI121上进行酶切，并经过酶标、测序进行鉴定。
构建转录本融合体及荧光质粒
利用PCR扩增得到的GhRCA1基因启动子与GFP基因进行重组连接，将其导入转录本融合体pCAMBIA1304上构建重组质粒，并经过酶切验证。以GFP基因为目的基因，利用PCR技术将构建好的质粒导入大肠杆菌中，经回收纯化后，通过存在Xhol和SacⅠ酶切不同的识别位点导入荧光质粒，获得荧光质粒重组体。
转染棉花细胞
将制备好的荧光质粒重组体导入棉花叶片的上表皮细胞中进行转染，转染体积占细胞体积的3%。转染过程在12h后将细胞放入恒温箱平衡1h，然后选用荧光激光显微镜检视细胞内GFP表达并通过数据统计进行结果分析。
结果
克隆GhRCA1基因启动子
本研究首先利用PCR技术成功克隆了GhRCA1基因启动子，并经过序列分析验证其长度为1748bp。
构建转录本融合体及荧光质粒
将GhRCA1基因启动子与目的基因GFP进行重组连接，并将重组体导入质粒，并通过PCR验证导入重组质粒的成功。然后利用PCR技术将构建好的质粒导入大肠菌中进行回收纯化，通过酶切后导入荧光质粒中，并酶标、测序鉴定其正确性。
转染棉花细胞
将制备好的荧光质粒重组体导入棉花叶片的上表皮细胞中进行转染，通过荧光激光显微镜检视细胞内GFP表达情况。结果表明，经过转染的细胞GFP表达较强，GhRCA1基因启动子对于驱动GFP基因表达具有较强的稳定性和活力。
讨论与结论
本研究中利用PCR技术成功克隆了GhRCA1基因启动子，并将其应用到荧光质粒中。荧光质粒的转染表现出硕大的亮度且表达效率较高，并且对于驱动融合体的表达均具有较强的稳定性。这一结果表明该启动子在驱动基因表达时具有较为重要的作用，该启动子的调控可能涉及到棉花生长发育、抗病性及物质的转运、信号传递等方面。这些结果表明，该启动子将为棉花的可持续发展提供新的内部分子保障。
总之，本研究成功地克隆了棉花GhRCA1基因启动子，并通过构建转录本融合体及荧光质粒的方式验证了该启动子的稳定性和活力。本研究所发现的GhRCA1基因启动子可以为棉花相关领域的研究与改良提供新的机遇和思路。