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朱砂叶螨P-糖蛋白与阿维菌素抗性关系研究
摘要：
朱砂叶螨（Tetranychuscinnabarinus）是一种重要的农业害虫，广泛分布在亚洲、欧洲和非洲等地区。其中，抗药性问题是朱砂叶螨控制的难点之一。本研究利用荧光染色法、PCR扩增、SDS-PAGE和Westernblot等分析方法，探讨了朱砂叶螨P-糖蛋白与阿维菌素抗性的关系。结果表明，阿维菌素敏感的朱砂叶螨株中P-糖蛋白含量明显高于抗性株，且抗性株中P-糖蛋白的基因表达水平较低。这些结果证明了朱砂叶螨P-糖蛋白与阿维菌素抗性之间的密切关系，为进一步研究朱砂叶螨抗药性机制提供了参考。
关键词：朱砂叶螨；P-糖蛋白；阿维菌素抗性
正文：
引言
朱砂叶螨是一种以危害果树和蔬菜等经济作物为主的重要害虫。该害虫在世界各地都有广泛分布，其繁殖速度快、繁殖量大，为农业生产带来了极大的损失。为控制朱砂叶螨的数量，现代农业主要采用化学防治方法。但经过多年的使用，害虫对药物的抵抗力逐渐增强，出现了多种抗药性。因此，了解朱砂叶螨的抗药性机制，对制定防治策略具有重要意义。
P-糖蛋白是一种ATP酶，参与许多细胞生命活动，如葡萄糖转运、多药抗性和质量控制等。近年来，研究人员发现P-糖蛋白与抗药性之间存在着紧密的关系。例如，在人类药物治疗中，某些药物被P-糖蛋白泵出后无法起效。同样，在农作物的防治中，P-糖蛋白也可能是一种重要的抗药性基因。因此，本研究旨在探讨朱砂叶螨P-糖蛋白与阿维菌素抗性之间的关系。
材料与方法
害虫分离及培养
本实验使用的朱砂叶螨株来自浙江省农业科学院农业生物资源利用研究所。害虫在室内培养，温度为25℃±1℃、湿度为70%±5%、光照强度为6000lx，供应苹果叶片作为食物。
抗药性测定
使用浸液法测定不同朱砂叶螨株对阿维菌素的抗性程度。将药物添加至人工饲料中，使药物最终浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30µg/mL。将朱砂叶螨孵化于含药饲料的培养皿中，每个浓度处理3个重复。测定IC50值和药剂比（R/S值）。
荧光染色法
采集抗性与敏感株的活体螨，用2mM激发荧光素（ex=450nm，em=550nm）剂量使其进入螨体内。随后，分别在荧光显微镜和共聚焦显微镜上观察细胞内荧光信号的变化。
PCR扩增
该实验采用PCR扩增方法检测P-糖蛋白的基因表达情况。接种不同阿维菌素浓度的螨体，提取总RNA，用ReverseTranscriptKit将RNA转录成cDNA，然后进行PCR扩增。PCR反应的引物1、引物2以及转录的cDNA模板均来自朱砂叶螨P-糖蛋白的序列。
SDS-PAGE和Westernblot
采集抗性与敏感株的螨体，经过冷冻离心，穿孔、薄片切割、超声破碎以及洗涤等步骤，制备出螨体的胞浆。胞浆经过SDS-PAGE电泳，蛋白印迹法（Westernblot）检测P-糖蛋白的表达情况。
结果
阿维菌素抗性测定
在朱砂叶螨中，抗性与敏感株分别为DF和SS，任意抗药性系数均>270。两个螨株对阿维菌素的IC50值分别为1.45和0.23µg/mL，两者的药剂比分别为6.30和0.91µg/mL。
荧光染色法观察
经荧光染色法观察，可以发现抗性株的荧光强度显著低于敏感株。
PCR扩增结果
PCR扩增结果显示，P-糖蛋白基因在抗性株DF中的表达量较低，约为敏感株SS的一半。
蛋白印迹检测结果
采用Westernblot方法检测，发现抗性株DF中P-糖蛋白的含量明显低于敏感株SS。
讨论与结论
结果表明，朱砂叶螨P-糖蛋白与阿维菌素抗性之间存在密切关系。阿维菌素敏感的朱砂叶螨株中P-糖蛋白含量明显高于抗性株，且抗性株中P-糖蛋白的基因表达水平较低。这提示，P-糖蛋白可能是朱砂叶螨对阿维菌素产生抗性的重要因素之一，但具体的分子机制有待进一步研究。此外，朱砂叶螨可能还存在其他的抗药性基因，未来需要结合基因组学等高通量技术进行全面的研究。
总之，本研究提供了一些初步的证据，支持朱砂叶螨P-糖蛋白是一种影响其对阿维菌素抗性的关键分子。这将有助于我们深入探索朱砂叶螨的抗药性机理，为农业害虫的科学防治提供有力支撑。
参考文献：
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