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法夫酵母虾青素合成酶基因的原核表达研究及其表达差异分析
摘要
法夫酵母(Fusariumoxysporum)能够生产虾青素(astaxanthin)，而其合成酶基因的表达对于虾青素的生产至关重要。本研究利用原核表达系统，成功地表达了法夫酵母的虾青素合成酶基因。同时，通过对表达差异的分析，我们发现，不同条件下对该基因的表达水平存在明显的差异，这为以后虾青素的高效生产提供了一定的理论基础。
关键词：法夫酵母；虾青素；合成酶基因；原核表达system；表达差异
引言
虾青素(astaxanthin)是一种广泛应用于食品和化妆品等领域的天然色素。法夫酵母(Fusariumoxysporum)是一种产生虾青素的微生物，其合成虾青素的途径与同属于真菌的产生虾青素的马铃薯蓟马不同。法夫酵母的合成途径主要涉及到光合作用、异黄酮的合成、和虾青素的生合成等等，其中虾青素的合成酶基因显得尤为重要。
在过去的研究中，人们主要关注于虾青素和其他生物类胡萝卜素的生物合成途径，以及这些途径在基因调控层面上扮演的角色。但是，基于细胞工程技术的相关研究，则更加着重于如何高效地表达虾青素的合成酶基因。因此，本研究将利用原核表达系统，转化法夫酵母的虾青素酶基因，以此得到原核培养下该基因的表达水平，并对表达差异进行进一步的分析。
材料与方法
菌株与质粒
法夫酵母野生菌株(Fusariumoxysporum)是我们实验中使用的主要微生物，其使用的质粒为pET21a(+)。其中，pET21a(+)是一种带有T7启动子和14个His标签序列的原核表达质粒，可以用来高效地表达重组蛋白。
PCR扩增
使用法夫酵母的基因组DNA为模板，利用合成引物将其虾青素合成酶基因进行PCR扩增。PCR的反应条件如下：其中每个反应体系包含10ng的基因组DNA，2.5mM的dNTPs，0.5μM的引物，以及高保真度TaqDNA聚合酶。
原核表达
将PCR扩增得到的虾青素合成酶基因，插入到pET21a(+)质粒的多克隆位点中。接下来，将得到的重组质粒pET21a(+)-虾青素合成酶基因转化到E.coliBL21(DE3)中。用100μg/mL的氨苄青霉素培养5小时后，于25℃下诱导表达。
蛋白质提取及鉴定
用组织破碎酶将大肠杆菌BL21(DE3)的总蛋白进行裂解，最后在进行纯化后对产品进行鉴定。
结果及讨论
PCR扩增结果表明，我们成功地扩增得到了法夫酵母的虾青素合成酶基因片段，并成功地插入到了重组质粒pET21a(+)中。最终，在使用E.coliBL21(DE3)进行表达后，我们成功地获得了重组的虾青素合成酶蛋白。
为了从不同条件下分析基因表达水平的差异，我们在表达过程中分别添加了激动剂和抑制剂，并分别评估了这些变化对基因表达的影响。结果表明，在加入激动剂的情况下，虾青素合成酶基因的表达水平有明显的提高。而当加入抑制剂时，则发现基因的表达水平会显著降低。
结论
本研究成功地利用原核表达系统，表达了法夫酵母的虾青素合成酶基因，并分析了该基因在不同条件下的表达水平。这对于解析虾青素合成的分子机制，以及制备虾青素有重要的意义。同时，在未来进行虾青素的大规模生产时，这些结果也可能有助于提高虾青素的产量和纯度。