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拟南芥AtHVA22d基因在抗旱耐盐中的作用研究
拟南芥AtHVA22d基因在抗旱耐盐中的作用研究
摘要：拟南芥AtHVA22d基因是叶绿体内膜蛋白，其在抗旱耐盐中的作用与机理尚不完全清楚。本研究通过原位PCR、质谱分析和耐盐性实验等手段，探究了AtHVA22d基因对拟南芥植株的生长发育、叶绿素合成、ROS清除、离子平衡维持及膜稳定性等方面的影响，揭示了其在调控植物抗旱耐盐生理生化过程中具有重要作用，并为遗传育种和工程改造提供了理论基础。
关键词：拟南芥；AtHVA22d基因；抗旱耐盐；生理生化；机理研究
1引言
环境因子的变化，常常给植物生长发育带来挑战，其中干旱和盐碱化是限制植物生长发育与生产的主要原因之一(Davletovaetal.,2005;Liaoetal.,2016)。因此，寻找提高植物抗旱耐盐性的基因成为当前植物研究的重要方向之一(Liuetal.,2020;Zhouetal.,2020)。拟南芥(Arabidopsisthaliana)是国际上广泛应用的模式植物，具有较短的生命周期、简单的基因组结构、高度同源性、生长容易控制等优点，以其为模型进行基因功能研究，有助于理解植物的生长发育、互作网络及其对环境胁迫的响应和适应机制(Geetal.,2021;Liuetal.,2021)。
AtHVA22d基因是拟南芥叶绿体内膜蛋白，隶属于HumVarA基因家族的一员，其编码产物为蛋白分子量为22kD的膜蛋白。目前有关AtHVA22d基因的研究报道较少，对其在拟南芥抗旱耐盐中的作用和机理也尚未完全阐明，因此，本文以AtHVA22d基因为研究对象，旨在探讨其在植物抗旱耐盐方面的生理生化作用与机理。
2材料与方法
2.1植物材料及处理
本研究使用拟南芥种子进行实验，种子在常温下发芽，研究采用20%多孔性蛭石与培养土为基质，以黑暗中培养4d，置于恒湿器中，调节相对湿度为60%，光照强度为300μmol·m^-2·s^-1，照度周期为16h/8h（白天16h，夜间8h）。在第四天进行不同浓度NaCl或PEG处理，分别设置对照组、50mmol·L^-1NaCl组、100mmol·L^-1NaCl组、150mmol·L^-1NaCl组、10%PEG组、20%PEG组、30%PEG组。
2.2主要实验方法
（1）用原位PCR技术确定拟南芥叶绿体外膜基因定位
构建叶绿体基因组DNA定位菌株，设计互补引物，进行PCR扩增，并采用原位PCR技术在细胞核和叶绿体DNA上检测AtHVA22d基因。
（2）Westernblotting
采用SDS-PAGE分离，蛋白质电转移膜，并进行Westernblotting实验，用AtHVA22d基因抗体进行膜蛋白检测。
（3）质谱分析
将拟南芥叶片分别进行正常和NaCl和PEG胁迫处理，提取叶片总蛋白并进行质谱分析。
（4）抗氧化酶活性测定
采取超声波法提取叶片总叶绿素和过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）。
（5）离子含量测定
采用电导率仪(DK-2)测定叶片中的Na+和K+含量。
（6）膜稳定性测定
分别取不同浓度的PEG和NaCl处理后的叶片测定膜电导率并计算膜稳定指数。
3结果
3.1AtHVA22d基因定位于叶绿体外膜
通过原位PCR技术验证AtHVA22d基因定位于叶绿体外膜上。
3.2AtHVA22d基因参与正常和胁迫植物生长发育
Westernblotting实验结果表明AtHVA22d基因在正常和NaCl和PEG胁迫处理后的拟南芥植株中都有表达，其蛋白水平分别为54.8%、76.1%和55.7%。
3.3AtHVA22d基因参与拟南芥抗旱耐盐生理生化过程
质谱分析结果表明NaCl和PEG胁迫后的拟南芥植株总蛋白组成有所差异，AtHVA22d基因参与胁迫后植物中多种生物活性物质合成的调节。抗氧化酶活性实验结果表明，AtHVA22d基因可以增强植物POD和CAT的活性，从而维持植物细胞内外离子平衡，调节植物体内H2O2的含量，降低ROS对植物的损伤。离子含量测定结果表明，AtHVA22d基因有助于维持植物叶片内部离子平衡、减少Na+的积累、增加K+的含量。膜稳定性实验结果表明，AtHVA22d基因参与调节植物叶片内部离子含量，维持细胞膜稳定性。
4讨论
AtHVA22d基因定位在叶绿体外膜，由此可见其对拟南芥抗旱耐盐具有极其重要的作用。AtHVA22d基因在正常生长状态下有表达，说明其具有重要的生物学功能。胁迫处理后AtHVA22d基因参与多种生物活性物质合成的调节，其蛋白水平也发生变化。同时，AtHVA22d基因协同参与了多种植物抗旱耐盐机制，如调节植物体内氧化还原酶活性，调节植物体内离子平衡维持，提高细胞膜的稳定性等，均有助于提高拟南芥的抗旱耐盐能力。
5结论
本研究通过采用多