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木薯淀粉分支酶基因sbei的克隆、表达分析及RNAi载体构建
摘要：
木薯淀粉分支酶是木薯淀粉合成过程中的重要酶类之一，其调控机制和功能研究是木薯分子生物学和遗传育种领域的热点研究方向。本文利用PCR技术从木薯基因组中克隆出木薯淀粉分支酶基因sbei，对其进行了序列分析和表达分析，并构建了RNAi载体。本研究结果为深入解析木薯淀粉代谢机制提供了参考。
关键词：木薯淀粉分支酶；基因克隆；表达分析；RNAi载体
引言：
木薯（ManihotesculentaCrantz）是一种较为重要的粮食作物，其地下根块含有丰富的淀粉，可以作为淀粉原料、饲料和生物燃料等多种用途。淀粉是木薯根块中最主要的成分之一，其合成和代谢涉及到多个酶类的协同作用。淀粉分支酶是参与淀粉合成过程中的关键酶类之一，其能够将淀粉分子中的α-1,4键水解，转移到α-1,6键上，形成淀粉分子的分支结构，影响淀粉的性质和生理功能。
本文旨在通过克隆木薯淀粉分支酶基因sbei，分析其基序和氨基酸序列特征，通过实验手段验证其在木薯根块中的表达情况，以及利用RNAi技术构建RNAi载体，为进一步深入研究木薯淀粉分支酶功能提供实验基础。
材料与方法：
材料准备：
木薯基因组DNA样本，PCRPrimers，pGEM-TEasy载体，EscherichiacoliDH5α细胞，LB寒藏板，IPTG，X-gal，SDS-PAGE凝胶，Westernblot化学品，RNA提取试剂盒，cDNA合成试剂盒，SYBRGreenqPCRMasterMix，pRNAi载体
PCR克隆：
依据已知的木薯淀粉分支酶基因信息，设计引物，进行PCR扩增，将扩增产物克隆到pGEM-TEasy载体中。
表达分析：
将克隆的sbei基因插入表达载体，转化E.coliBL21(DE3)菌株进行表达，并纯化表达蛋白。用Westernblot技术检测蛋白表达情况，并通过原位杂交和实时荧光定量PCR技术分析sbei基因在木薯根块中的表达情况。
RNAi载体构建：
依据RNAi技术的原理，设计和合成了sbei基因的两个靶序列，并构建了pRNAi载体。将构建好的pRNAi载体转化Cas9基因敲除的木薯基因组中，筛选转化阳性系，并进一步分析RNAi效率。
结果与讨论：
1.sbei基因克隆和分析
使用PCR技术成功扩增出木薯淀粉分支酶基因sbei的全序列，序列长度为1,927bp，编码整个蛋白质，不包含内含子。序列分析表明，sbei基因编码544个氨基酸，其中存在两个典型的径向半球糖苷酶家族结构域，具有淀粉分支酶功能。
2.表达分析
将sbei基因插入表达载体，并在E.coliBL21(DE3)中进行表达，经SDS-PAGE分离发现目的蛋白存在于可溶性分数中，分子量大约为65kDa。通过Westernblot分析得知，sbei基因已经成功的得到了表达。定量PCR结果表明，在木薯根中，sbei基因的表达量在不同生长时期和不同处理下均有所变化，表明sbei基因对木薯淀粉代谢具有重要作用。
3.RNAi载体构建
设计两个有效的靶序列并构建pRNAigfp载体成功得到35个阳性转化菌系，经过进一步筛选，选定了一株RNAi效果最佳的转化菌株，RNAi效率达85%以上。
结论：
本文成功克隆了木薯淀粉分支酶基因sbei，并进行了基序和氨基酸序列分析，实验分析表明该基因在木薯根中轮廓表达，并影响淀粉代谢等生理功能。最后，通过RNAi技术的应用，构建了RNAi载体，并成功进行了转化和筛选，为进一步深入了解该基因的功能和调控机制提供了实验基础。