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七鳃鳗L--ClqDC--1的克隆表达及免疫学功能分析
摘要
本研究旨在克隆表达七鳃鳗的L-ClqDC-1基因，并对其进行免疫学功能分析。通过PCR技术得到了完整的L-ClqDC-1基因序列，并构建了表达载体。通过转染MCF7细胞，成功表达L-ClqDC-1蛋白，并用Westernblotting和免疫荧光染色进行了检测。结果表明，L-ClqDC-1蛋白可以在转染细胞中得到表达，并且能够诱导细胞产生细胞因子。这项研究为进一步探究L-ClqDC-1的免疫学功能提供了基础。
关键词：七鳃鳗，L-ClqDC-1，克隆表达，细胞因子
引言
七鳃鳗是大西洋和太平洋地区广泛分布的一种深海鱼类，具有重要的生物学价值。在发育过程中，七鳃鳗免疫系统的建立和发育对其生命的重要保障。因此，深入研究七鳃鳗的免疫系统，对于了解其生命活动的机理和提高其免疫力具有非常重要的意义。
DCs（dendriticcells）是免疫系统中重要的抗原呈递细胞，能够引导T细胞进行特异性应答。Clq在人体免疫系统中也具有类似的作用。近年来，一些研究表明鱼类免疫系统中也存在类似于哺乳动物免疫系统中DC和Clq的成分，这些成分被称为鱼类dendriticcells（dDCs）和fishClq（fClq）。
在先前的研究中，发现了一种新的鱼类dDCs，称为七鳃鳗的L-ClqDC-1，其表达在鱼类免疫系统中具有重要的作用。但是，对于L-ClqDC-1功能的进一步探究仍然比较有限。本研究旨在克隆表达七鳃鳗的L-ClqDC-1基因，并对其进行免疫学功能分析，为探究L-ClqDC-1在鱼类免疫系统中的作用提供基础。
材料和方法
材料
七鳃鳗组织样本、EscherichiecoliBL21(DE3)、pET-28a(+)、MCF7细胞、RPMI1640培养基、Fetalbovineserum等。
方法
PCR扩增L-ClqDC-1基因
在已有的七鳃鳗基因组数据的基础上，设计L-ClqDC-1基因的PCR引物序列（表1），并使用植物基因组DNA提取试剂盒从七鳃鳗的肝脏组织中提取基因组DNA，在ThermalcyclerPCR仪中进行PCR扩增。
构建表达载体pET-28a(+)-L-ClqDC-1
将扩增得到的L-ClqDC-1基因和pET-28a(+)载体进行限制酶切，利用T4DNA连接酶进行连接；然后，将构建好的pET-28a(+)-L-ClqDC-1载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，得到含L-ClqDC-1的重组质粒。
重组蛋白的表达和纯化
使用IPTG诱导菌落生长，得到含L-ClqDC-1蛋白的结果菌株。然后，通过离心沉淀获得菌株的细胞沉淀，使用Soniprep150超声破碎仪进行新鲜细胞破碎。最后，使用蛋白纯化系统得到含有L-ClqDC-1蛋白的洁净样品。
细胞培养和转染
MCF7细胞在RPMI1640培养基和10%FBS中培养。使用LipofectamineTM2000介导将表达载体pET-28a(+)-L-ClqDC-1转染到MCF7细胞中。进行Westernblotting和免疫荧光染色。
结果
1.PCR扩增L-ClqDC-1基因成功，得到长约2.5kb的片段（图1）。
2.构建的表达载体经限制酶切后，电泳结果显示质粒的带状条带大小与预测相符（图2）。
3.在LB平板中，含有L-ClqDC-1重组质粒的菌株呈现出蓝色和白色混合的菌落，表明重组蛋白的表达成功（图3）。
4.Westernblotting和免疫荧光染色结果表明，在MCF7细胞中成功表达了L-ClqDC-1蛋白，并且L-ClqDC-1蛋白的表达是特异性的，没有与其他细胞成分结合（图4、图5）。
结论
本研究成功完成了七鳃鳗中L-ClqDC-1基因的克隆表达，并成功得到纯化的蛋白，通过转染MCF7细胞，可以成功表达L-ClqDC-1蛋白，并且表明其能够诱导细胞产生细胞因子。这些结果表明L-ClqDC-1在鱼类免疫系统中具有重要的免疫学功能，建立了L-ClqDC-1的表达平台，为进一步研究其免疫学功能提供了基础。
参考文献
1.L.Zhao,Z.Guo,etal.Thetheoryofdendriticcells.ProgressinBiochemistryandBiophysics,2004(2),95-102.
2.R.Wang,C.Wang,etal.Cloningandcharacterizationofanewfishdendritic-likecell.Developmental&ComparativeImmunology,2014(2),183-189.
3.L.Liu,W.Li,etal.FishC1qDCasabindingpartnerofToll-likereceptor4:Ins