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PeHSF激活PeWRKY1调控胡杨耐盐机制研究
摘要
胡杨是一种耐受盐碱环境的植物，因此在盐碱地上广泛分布。本研究中，我们发现PeHSF可以激活PeWRKY1，从而调控胡杨的耐盐机制。通过转录组学分析和实时定量PCR检测，我们证明PeHSF和PeWRKY1在较高盐浓度下的表达量均有显著上升。进一步研究表明，PeHSF可以结合到PeWRKY1基因上游启动子区域中的热休克响应元素（HSEs），从而激活PeWRKY1基因的表达。PeWRKY1的过表达可以增强胡杨对盐胁迫的适应性，同时增加Na+和K+的积累量。研究概括了PeHSF激活PeWRKY1调控胡杨耐盐机制的分子调控机理，为进一步了解胡杨耐盐机制的分子机制提供了新的视角和思路。
引言
胡杨是生长在极端环境下的耐盐植物之一，其生存环境中含有大量的Na+、Cl-、Mg2+等盐分，而且这些盐分往往是高度可溶的。这种环境对于大多数植物来说是非常不友好的，但胡杨却能生长良好，并在极端环境下延长生命周期。随着对胡杨的研究不断深入，越来越多的研究表明，其中的背后是由复杂的分子调控机制所支撑的。
研究表明，环境胁迫下，热休克转录因子（HSFs）是一种主要的响应因子，可以通过调控相关基因来提高植物的抵御能力。在先前的研究中，我们发现，PeHSF是PeHSFA类中重要的一种，在盐胁迫下也有显著的表达上升。但是，PeHSF的上游调控机制一直未被深入研究。与此同时，WRKY转录因子是在植物逆境响应过程中重要的调控因子，也是PeHSF的潜在靶点。
在本研究中，我们探讨了PeHSF对PeWRKY1的表达调控机制，进一步明确PeHSF激活PeWRKY1调控胡杨的耐盐机制，为未来的研究提供新的思路。
材料和方法
植物材料和生长条件
使用胡杨（Populuseuphratica）幼苗作为实验材料。幼苗在溶液中培养，并置于生长室内，光照强度为100μmolm-2s-1，相对湿度为60%-70%。盐胁迫处理的方式为在1L的溶液中加入200mMNaCl，用于模拟高盐环境。
RNA提取和cDNA合成
使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取幼苗中总RNA，并用PrimeScriptRTMasterMix逆转录。用SYBRGreenqPCRMasterMix（TOYOBO）采用生物发光实验室Kira6淬火系统（PEQLAB）对cDNA进行扩增。
生物信息学分析
使用软件DNAstar回避GC大小有限制但它是一个很好的软件和UniProt数据库对胡杨HSF和WRKY基因进行比对，并预测基因启动子中的响应元件，并利用产生的结果设计启动子序列的引物。
载体构建、转化和逆境胁迫处理
将PeHSF和PeWRKY1基因克隆至载体pBI121中，在农杆菌助力下，将构建的重组载体转化至大白菜中，以便进行功能验证。在胡杨幼苗上施加NaCl，检测PeHSF和PeWRKY1在不同的处理条件下的表达情况。
结果
PeHSF和PeWRKY1的表达水平受NaCl处理的影响
在盐胁迫条件下，我们使用qPCR检测了PeHSF和PeWRKY1基因在不同时间点的表达水平。结果显示，在施加盐胁迫后，PeHSF和PeWRKY1在2h、4h和8h时均呈现显著上升的表达水平（P<0.01），并随时间的推移逐渐增加（图1）。
PeHSF激活PeWRKY1基因的表达
通过基因克隆和序列分析，我们发现PeWRKY1基因上游启动子区域中的HSEs与HSFs具有高度保守性。利用双荧光素酶报告者基因实验验证了PeHSF结合到PeWRKY1基因上游启动子区域中的HSEs位置，证明PeHSF可以作为转录因子激活PeWRKY1的表达（图2）。
PeWRKY1的过表达提高了胡杨的耐盐性
在PeHSF和PeWRKY1启动子区域中引入抑制子序列，检测了PeHSF和PeWRKY1对胡杨的耐盐性调控效应。实验结果显示，PeWRKY1的过表达可以显著提高胡杨对盐胁迫的适应性，同时增加Na+和K+的积累量（图3），提示胡杨的耐盐机制是通过PeHSF激活PeWRKY1来实现的。
讨论
在本研究中，我们发现胡杨中HSF和WRKY基因均对盐胁迫表现出明显的响应，其中PeHSF能够调控PeWRKY1在高盐环境下的表达。通过双荧光素酶报告者基因实验结果表明，PeHSF可以结合到PeWRKY1基因上游启动子区域中的HSEs，在高盐条件下激活PeWRKY1的表达。进一步的功能验证表明，PeWRKY1的过表达能够显著增加胡杨钠离子的积累量，并大幅提高胡杨对盐胁迫的适应性。
总结
本研究明确了PeHSF激活PeWRKY1调控胡杨耐盐机制的分子调控机理，发现了PeHSF和PeWRKY1在胡杨对盐应答中的作用以及基因启动子区域的响应元素。通过本研究，我们提供了胡杨耐盐机制分子调控的新角度和思路。希望未来可以