医学专题—细菌内毒素检查法干扰试验.ppt

细菌(xìjūn)内毒素检查法干扰试验

讲解董光宴

湛江博康海洋生物有限公司实验(shíyàn)基本流程图供试品
新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时，常常会遇到各种各样的困难，尤其是尚处于(chǔyú)新药研发早期阶段的药物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样就给方法的建立带来不同程度的影响。供试品
在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息(xìnxī)，例如：
有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；
样品的pH范围；
分子量大小；
产品规格、体积或重量；
拟用于临床的用法和用量等等。限值的确定
1、依据
2010年版《中国药典》附录“细菌内毒素检查用水”
2010年版《中国药典》二部附录“化学药品注射剂安全性检查法应用指导(zhǐdǎo)原则”干扰试验

当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境(huánjìng)中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
——2010版药典干扰试验

药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查(jiǎnchá)，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查(jiǎnchá)的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查(jiǎnchá)。
——2010版《中国药品检验标准操作规范》干扰试验
干扰实验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。
——2010版《中国(zhōnɡɡuó)药品检验标准操作规范》干扰试验
由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关(wúguān)，因此在干扰实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但建议使用较低灵敏度（如0.50或0.25EU/ml）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。
——2010版《中国药品检验标准操作规范》举例(jǔlì):
1试剂和样品
鲎试剂（生产单位：湛江博康海洋生物有限公司，灵敏度：0.25EU/ml）
细菌内毒素检查用水
细菌内毒素工作标准品（中检所提供）
西咪替丁氯化钠注射液（【规格】50ml:西咪替丁0.2g与氯化钠0.45gP258）2限值的确定
内毒素限值L=0.50EU/ml（2010年版《中国(zhōnɡɡuó)药典》二部正文258页）。3干扰试验浓度的计算
按照(ànzhào)中国药典2005年版提供的公式计算最大有效稀释倍数，计算方法如下：
3.1选用灵敏度为：0.25EU/ml时：
MVD=CL/λ=1×0.5/0.25=2倍
3.2选用灵敏度为：0.125EU/ml时：
MVD=CL/λ=1×0.5/0.125=4倍4预试验
4.1目的
初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/U表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示）,为正式干扰试验提供(tígōng)依据。
优点：减少摸索过程、节省成本4.2操作方法
由于干扰试验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所用鲎试剂的灵敏度无关(wúguān)，因此在干扰试验的预试验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但建议使用较低灵敏度（0.5或0.25EU/ml）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰试验造成的阳性影响。将供试品溶液进行一系列倍数(bèishù)的稀释，但最大的稀释倍数(bèishù)不得超过MVD=CL/λ0.03
使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。
每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即含2.0λ浓度标准内毒素的该浓度的供试品稀释液）。
另做2支阴性对照，和2支阳性对照。4.3结果判断
当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。
当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下可能无干扰，可选择(xuǎnzé)该稀释倍数进行正式干扰实验。样品信息
结果预试验结果，样品西咪替丁氯化钠注射液在2-8倍稀释范围内不存在明显(míngxiǎn)的增强和抑制作用，可选用其中任一浓度做该样品的细菌内毒素干扰试验。5干扰(gānrǎo)试验溶液的制备5.1供试品溶液
样品西咪替丁氯化钠注射液的稀释：
用细菌内毒素检查用水将其稀释到2倍和4倍稀释液备用。操作过程必须严格遵守无菌操作规程，保证无外源物质(wùzhì)的干扰。西咪替丁氯化钠注射液原液5.2鲎试剂(sh