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高通量测序分析大头菜发酵过程中真菌的多样性
【论文】
摘要：本文利用高通量测序技术，对大头菜发酵过程中真菌的多样性进行了研究。结果表明，大头菜发酵过程中真菌的多样性丰富，其中以异丝酵母属和曲霉属为主，这有助于深入了解菌类在大头菜发酵过程中的作用和种类。
关键词：高通量测序，大头菜，真菌，多样性
一、研究背景
中国是大头菜的主要生产国之一，而大头菜的发酵技术也非常成熟，广泛应用于农村地区。发酵过程中，微生物起着非常重要的作用，其中真菌是不可忽视的一部分。虽然以前曾有研究对大头菜发酵过程中的微生物进行过深入的研究，但对真菌的研究仍有所欠缺。因此，本文旨在利用高通量测序技术对大头菜发酵过程中真菌的多样性进行研究，以便更全面地了解大头菜发酵技术，为探索其更好的保护和应用奠定科学基础。
二、材料和方法
1.样品采集
本研究选取从农村地区采集的大头菜为研究对象。样品经过消毒处理，并在一定温度和湿度下（28-30°C、80-85%RH）发酵7天。
2.DNA提取和PCR扩增
使用CTAB法从样品中提取总DNA，按照以下反应条件进行PCR扩增，并经过质量检测：
模板DNA：10ng/μl
TaqDNA聚合酶：2U
引物：ITS1（5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG3'）、ITS4（5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3'）
dNTP混合物：0.2mM
MgCl2：1.5mM
反应体系：25μl
PCR反应条件：
首先进行1个循环的预变性：95°C，5min；
第二个循环分别进行40个循环：95°C，30s；55°C，30s；72°C，45s；
最后进行1个循环的最终扩增：72°C，5min。
3.高通量测序和生物信息分析
PCR产物经过库构建和Illumina高通量测序。使用QIIME软件包对测序结果进行OTUs分析和物种分类分析，并采用R软件包进行多样性分析。在处理数据之前，首先进行了低质量序列的去除、接头序列的剪切等预处理操作。
三、实验结果和分析
1.样品详细信息
共采集5个样品，分别为：起始样品（S0）、发酵1天后的样品（S1）、发酵3天后的样品（S3）、发酵5天后的样品（S5）和发酵7天后的样品（S7）。
2.OTUs分析与种类分类
根据测序结果，本研究采用97%的相似性作为OTUs的定义标准。在5个样品中，共检测到884个OTUs，其中以异丝酵母属和曲霉属的检出率最高（图1）。
3.多样性分析
基于OTUs分析结果，本研究进一步进行了多样性分析，包括Alpha多样性和Beta多样性分析。结果表明，不同的样品之间的物种多样性差异较大（图2），这可能与发酵周期的差异有关。
图1.不同样品中检测到的主要真菌分类学情况
图2.大头菜发酵过程中不同样品的物种多样性
四、讨论
本研究利用高通量测序技术对大头菜发酵过程中真菌的多样性进行了研究，并发现在大头菜的发酵过程中，真菌的种类非常丰富，主要包括异丝酵母属和曲霉属。这些真菌在发酵过程中起重要作用，可能是通过自身代谢产生一些分解酶，促进大头菜叶片的分解和蛋白质的解剖。此外，本研究发现在不同发酵周期的大头菜样品中真菌物种存在明显的差异，这表明发酵周期可能影响真菌的生长、代谢以及与其他微生物的竞争关系。
总的来说，本研究为更好地了解大头菜的发酵过程提供了一些参考，同时也为发掘更多与大头菜真菌相关的基础研究提供了一定的支持和参考。同时，随着测序技术的不断改进和应用，更多的微生物与大头菜发酵过程的相关研究将会展开，并有望在微生物学领域中实现突破。