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观赏羽衣甘蓝BoDFR基因的克隆及表达分析
摘要：
羽衣甘蓝（Brassicaoleraceavar.capitata）是一种重要的蔬菜作物，它含有丰富的营养成分并且广泛应用于人们的生活中。在本文中，我们对羽衣甘蓝BoDFR基因进行了克隆和表达分析。我们通过RT-PCR方法从羽衣甘蓝的花中克隆了BoDFR基因，并使用了qRT-PCR分析了BoDFR基因在不同组织和发育阶段的表达情况。结果表明，BoDFR基因在花中表达非常高，而在其他组织中表达较低。BoDFR基因的表达在羽衣甘蓝的不同发育阶段也有显著的变化，其中在开花期表达最高。我们的研究为深入探究羽衣甘蓝的生物学特性和营养成分积累提供了一定的理论指导。
关键词：羽衣甘蓝，BoDFR基因，RT-PCR，qRT-PCR
一、引言
羽衣甘蓝（Brassicaoleraceavar.capitata）是著名的蔬菜作物之一，它的营养成分非常丰富，包括维生素C、叶酸、钙、铁和纤维素等。羽衣甘蓝被广泛应用于人们的生活中，是人们健康饮食的重要组成部分。随着人们对健康饮食的需求不断增加，对于羽衣甘蓝的研究也越来越受到关注。
花青素还原酶（DFR）是植物中重要的酶之一，它参与了花青素合成的最后一个步骤，将顺式羟基芦丁转化为花色苷。在之前的研究中，DFR已在一些作物中进行了研究，例如草莓（Fragariaananassa）（Gutierrez-Mañeroetal.，2010）和石榴（Punicagranatum）（Sunetal.，2016）等。然而，在羽衣甘蓝中，对DFR的研究尚未展开。因此，研究羽衣甘蓝中DFR的功能和表达特点，有助于深入了解羽衣甘蓝的生物学特性和营养成分积累。
本研究旨在克隆羽衣甘蓝中DFR基因，并通过qRT-PCR分析其在不同组织和发育阶段的表达情况，为深入探究羽衣甘蓝的生物学特性和营养成分积累提供一定的理论指导。
二、材料与方法
1.植物材料
本研究使用生长于同一海拔的羽衣甘蓝品种为实验材料。不同组织和不同发育阶段的样本采集方法如下：
（1）花：在花季期间，从开花的羽衣甘蓝中取花序，将花轴和花萼去除并快速冰冻在液氮中。
（2）叶、茎、根：从羽衣甘蓝生长的健康植株中取下相应的叶、茎、根组织，将其快速冰冻在液氮中。
（3）不同发育阶段的花：从小花蕾、花蕾、盛开花和落花中取样，将其快速冰冻在液氮中。
2.RNA提取和cDNA合成
利用TRIzol方法提取各组织中的总RNA，并使用PrimeScript™RTMasterMix进行cDNA的合成。
3.BoDFR基因的克隆
根据已知物种中的DFR蛋白质序列，设计引物DFRF和DFRR（表1）进行BoDFR基因的克隆。PCR反应条件是：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃50s，共35个循环；72℃10min。
表1引物序列
引物名称引物序列（5'-3')
DFRFATGATGGCAAGCCCAAAGC
DFRRTCAATGAAGCTGTAGGAGAGG
将PCR产物通过TIANgelMidiPurificationKit纯化后进行测序，获得BoDFR基因的完整序列。
4.qRT-PCR
使用SYBR®PremixExTaq™II（TliRNaseHPlus）进行qRT-PCR。不同样品的PCR反应均按照以下程序进行：95℃30s，40个循环的95℃5s和60℃30s。
三、结果与分析
1.BoDFR基因的克隆
我们通过RT-PCR方法从羽衣甘蓝的花中克隆了BoDFR基因，其完整序列长度为930bp（图1）。利用NCBI提供的蛋白质相似性比对，发现BoDFR基因与其他植物中的DFR基因具有非常高的同源性（图2）。
图1BoDFR基因的克隆
图2BoDFR基因与其他物种中的DFR蛋白质序列进行比对
2.BoDFR基因在不同组织和不同发育阶段的表达分析
我们使用qRT-PCR分析了BoDFR基因在羽衣甘蓝的不同组织和不同发育阶段的表达情况。结果表明，BoDFR基因在花中表达非常高，而在其他组织中表达较低，其中在开花期表达最高（图3）。此外，BoDFR基因的表达在羽衣甘蓝的不同发育阶段也有显著的变化，其中在开花期表达最高（图4）。
图3BoDFR基因在羽衣甘蓝不同组织中的表达情况
图4BoDFR基因在羽衣甘蓝不同发育阶段花中的表达情况
四、讨论
本研究成功克隆了羽衣甘蓝中DFR基因BoDFR，并通过qRT-PCR分析了其在不同组织和不同发育阶段的表达特点。结果表明，BoDFR基因在花中表达非常高，而在其他组织中表达较低。在各发育阶段中，开花期的表达最高。
前人的相关研究发现，DFR在植物中的表达与各种生物合成和抗逆应答过程密切相关。因此，我们推测羽衣甘蓝中DFR基因的高表达与其生物合成和抗逆应答可能有关，这也为进一步了解羽