质粒的提取与纯化ppt课件.ppt

实验一质粒的提取(碱法)实验目的
实验原理
实验仪器、材料与试剂
实验步骤
实验结果及讨论实验目的实验原理结构的三大要素：
多克隆位点
选择标记（耐药性，LacZ）
独立的复制单位
种类：
质粒
噬菌体
酵母人工染色体（YAC）
反转录病毒载体
表达载体等在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。

用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。
实验仪器、材料与试剂（二）材料（三）试剂2.SolutionⅠ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/LTris.·Cl(pH8.0)
10mmol/LEDTA(pH8.0)
高压灭菌后，4℃保存备用。
3.SolutionⅡ(现用现配制)
0.2mol/LNaOH
1%SDS
4.SolutionⅢ（100ml）
5mol/LKAc60ml
冰醋酸11.5ml
水28.5ml
配制成的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐、5mol/L醋酸（pH4.8）。
5.氨苄青霉素（Amp）
用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存备用。6.胰RNA酶
将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
7.氯仿，乙醇，70%乙醇。实验步骤5.12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新Eppendorf管中，注意所取体积（约600μL）。
6.加入等体积氯仿（约600μL），混匀（注意动作轻）。12,000rpm，4℃，离心10min，取上清液。
7.上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20℃沉淀20~30min。
8.12,000rpm离心15min。9.去上清，沉淀加入500μL70%乙醇洗涤2次（12,000rpm离心3分钟）。
10.去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。
11.每管中加入25μL无菌水1μLRNase，37℃溶解质粒DNA。Biospin质粒DNA小量提取试剂盒（实际用）

操作过程
1.将1～1.5ml过夜培养的细菌菌液加入1.5ml离心管中。
2.于10，000rpm离心30秒，并弃去上清液。
如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。
3.加250μlResuspensionBuffer，重悬细菌体沉淀。
重悬后应该没有细菌团块。4.加250μl细胞LysisBuffer，轻柔颠倒4～6次。
不要剧烈振动，以防止基因组DNA被剪切。注意不要让反应持续超过5分钟。
5.加350μlNeutralizationBuffer，立即轻柔颠倒离心管4～6次。
溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。
6.于13,000rpm离心10分钟。
如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。
7.将步骤6离心后得到的上清液转移到Spincolumn内。于6,000rpm离心1分钟，并弃去接液管内液体。

8.向Spincolumn内加650μlWashBuffer，于12，000g离心30～60秒，并弃去接液管内液体。
9.重复第8步一次。
10.再次于12，000rpm离心1分钟，然后将Spincolumn转移到无菌的1.5ml离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。
11.向Spincolumn内加20μlElutionBuffer、去离子水或TE溶液，并于室温静置1分钟。
可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。

12.于12，000rpm离心1分钟，1.5ml离心管内溶液中含有质粒DNA。
13.提取的质粒DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20℃。
实验结果及讨论