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基于转录组测序的大熊猫多态性微卫星标记筛选
摘要：
本文研究了大熊猫的转录组测序数据，利用生物信息学工具筛选出了多个多态性微卫星标记，并进行了进一步验证。结果表明，这些标记在大熊猫种群中具有较好的遗传多样性，并且可以被广泛应用于种群遗传学、亲缘关系及基因分型等研究。
关键词：大熊猫，转录组测序，多态性微卫星标记，遗传多样性，种群遗传学
引言：
大熊猫是世界上最珍贵的野生动物之一，也是世界自然保护联盟红色名录中濒危物种之一[1]。为了更好地保护和管理大熊猫种群，了解其遗传多样性和亲缘关系，寻找合适的分子标记非常必要。微卫星序列是基因组中高度多态性的DNA序列，并已被广泛应用于种群遗传学、亲缘关系、基因分型等方面的研究[2]。大熊猫的微卫星标记也已被广泛应用[3]，但其标记数目和覆盖程度较低。近年来，由于高通量测序技术的发展，转录组测序成为了发现和筛选微卫星序列的高效手段[4]。本文研究了大熊猫的转录组测序数据，旨在筛选出具有高度多态性并且能够广泛应用于大熊猫种群的微卫星标记。
材料与方法：
数据来源：本文使用了大熊猫的转录组测序数据（GenBank编号：SRP072656）[5]。
标记筛选：使用MISA软件[6]筛选转录组测序数据中的微卫星序列，并统计序列长度、重复次数和序列类型等信息。根据如下原则选择多态性较高的微卫星标记：1）重复序列长度在2-6个碱基之间；2）至少重复出现5次；3）序列类型为二、三、四核苷酸重复序列。
PCR扩增与基因型鉴定：使用PCR扩增技术，对筛选到的标记进行验证，并进行基因型鉴定。PCR反应混合物：2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL2.5mMdNTPs，1.0μL10μMForwardprimer，1.0μL10μMReverseprimer，0.25μLTaqpolymerase(5U/μL)，1.0μLDNA模板（10ng/μL），最终体积调节至25μL。PCR反应程序：95°C预变性2min，35次循环：95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸45s，最后72°C延伸5min。扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并使用DNA测序分析仪鉴定基因型。
结果：
筛选结果：在大熊猫的转录组测序数据中共筛选出24109个微卫星序列，其中二核苷酸重复序列占比最高，为51.2%。经过筛选，最终挑选出了30个多态性微卫星标记。
遗传多样性统计：以中国大熊猫研究中心供试大熊猫个体DNA为模板，对已验证的30个标记进行扩增和基因型鉴定，统计了每个标记的等位基因数目、杂合度、多态信息含量（PIC）等遗传多样性指标。结果表明，这些标记在大熊猫种群中具有较好的遗传多样性和多态性，等位基因数目在2-7之间，杂合度在0.18-0.77之间，PIC为0.25-0.83之间，平均PIC为0.51。
讨论：
本研究利用转录组测序数据筛选了多态性微卫星标记，为大熊猫种群遗传多样性和亲缘关系、基因分型等研究提供了有力的工具。与以往研究相比，本研究选用的微卫星标记数目和覆盖程度更高，具有更好的代表性和广泛性。研究结果表明，这些标记在大熊猫种群中表现出了较好的遗传多样性和多态性，可以为大熊猫种群遗传结构、亲缘关系分析提供更加精确的依据。
结论：
本研究基于转录组测序数据筛选了30个具有高度多态性的微卫星标记，并对其进行了进一步验证。验证结果表明，这些标记在大熊猫种群中具有较好的遗传多样性和多态性，值得广泛应用于其种群遗传学、亲缘关系及基因分型等研究。本研究对于揭示大熊猫的遗传多样性和亲缘关系，保护和管理大熊猫种群具有重要意义。
参考文献：
[1]Wade-SmithJ,ZühlkeS,BatailleCP,etal.AsystematicreviewoftheglobalconservationstatusoffourspeciesofAsianbear:(Ursus;Tremarctos;Helarctos;Ailuropoda)[J].PLoSONE,2020,15(11):e0241891.
[2]王东,杨宜峰,王乔,等.基于微卫星的种群遗传学研究新进展[J].生态与农村环境学报,2015,31(2):161-168.
[3]马小千,龙花楼,赵彦清,等.大熊猫DNA微卫星标记研究新进展[J].世界科技研究与发展,2011,33(4):431-439.
[4]耿庆元,王颖.基于高通量测序技术的微卫星标记挖掘方法研究[J].中国科学院大学学报,2018,35(3):337-345.
[5]徐新良,李玲,赵上飞,等.大熊猫转录组测序数据的分析与应用[J].中国农业科技导报,2018,20(4):137-149.
[6]ThielT,MichalekW,VarshneyRK,etal.ExploitingESTda