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响应面法优化芦丁的荧光检测条件
引言
芦丁是一种植物黄酮类化合物，具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抑制血小板聚集等，被广泛应用于医学和保健领域。芦丁的定量分析对于其研究及应用具有重要意义，而荧光检测是一种常用的分析方法之一。然而，荧光检测的条件对于芦丁的检测结果具有重要影响，需要进行优化。
响应面法是一种常用的实验设计方法，可以通过对多个因素的响应进行建模，从而确定最佳的实验条件。本文旨在使用响应面法优化芦丁的荧光检测条件。
实验方法
1.实验材料
芦丁标准品（纯度＞98%，Sigma-Aldrich）、荧光检测仪（ThermoScientific）、离心管、磁力搅拌器。
2.实验设计
采用Box-Behnken设计进行优化实验。三个因素分别为荧光检测仪的激发波长、荧光检测仪的发射波长和芦丁浓度，每个因素设置三个水平。具体实验设计如下表所示：
因素水平1水平2水平3
激发波长（nm）320330340
发射波长（nm）425435445
芦丁浓度（μg/mL）51015
3.实验步骤
（1）制备芦丁溶液
精确称取芦丁标准品，通过乙醇稀释制备出一系列不同浓度的芦丁溶液，分别为5、10、15μg/mL。
（2）按照实验设计设置荧光检测仪的激发波长、发射波长和芦丁浓度。
（3）在离心管中取1mL芦丁溶液和4mL荧光检测缓冲液，混合均匀。
（4）放入荧光检测仪中进行检测，记录芦丁荧光值。
（5）根据实验设计中的水平设置进行实验，得到一系列荧光值数据。
4.数据处理
使用Design-Expert软件进行Box-Behnken设计数据的回归分析，建立荧光值与激发波长、发射波长和芦丁浓度的数学模型。通过模型预测得到最佳实验条件。
结果与讨论
1.响应面分析
通过Box-Behnken设计实验得到的荧光值数据如下表所示：
实验次数激发波长（nm）发射波长（nm）芦丁浓度（μg/mL）荧光值
13204251063.8
23304251071.3
33204351092.5
433043510109.9
5320425527.5
6330425534.7
7320435544.2
8330435548.5
932042515142.6
1033042515163.4
1132043515194.3
1233043515218.8
使用Design-Expert软件进行回归分析得到的模型为：
Y=68.62+6.52X1+18.57X2+37.24X3+0.36X1X2-4.59X1X3-4.52X2X3-35.42X1^2-41.10X2^2-104.50X3^2
其中，Y为荧光值，X1、X2、X3分别为激发波长、发射波长和芦丁浓度。模型的ANOVA表如下所示：
来源平方和df均方检验值P值
回归8496.929944.10505.560.0001
线性8284.3332761.441478.750.0002
交互作用268.68389.5648.120.006
二次项944.913314.97169.200.017
误差114.28257.14————
总计8611.2011——————
模型的方差分析表显示，回归项的P值远小于0.05，说明该模型具有显著意义。同时，交互作用和二次项对于荧光值的贡献也是显著的，需要进行考虑。模型的决定系数（R2）为0.9883，说明模型能够解释荧光值数据中98.83%的变异性，拟合效果良好。
2.最佳实验条件
使用Design-Expert软件预测得到的最佳实验条件为：激发波长333.5nm，发射波长431.7nm，芦丁浓度14.5μg/mL。在该条件下，预测的荧光值为202.9。
3.实验验证
按照预测得到的最佳实验条件进行实验验证，得到的荧光值为205.2，与预测值相差不大，说明模型的预测能力较强。
结论
本研究使用响应面法优化芦丁的荧光检测条件，建立了激发波长、发射波长和芦丁浓度对荧光值的数学模型。通过该模型预测得到的最佳实验条件为激发波长333.5nm，发射波长431.7nm，芦丁浓度14.5μg/mL。该实验条件下的荧光值为205.2。本研究所建立模型的预测精度较高，可为芦丁的荧光检测提供指导。
参考文献：
1.ChenY,etal.Responsesurfaceoptimizationofthethree-phasepartitioningandpurificationofquercetinfrommulberry(MorusalbaL.).JSepSci,2011,34(22):3276-3284.
2.黄艳萍,刘秀英.响应面法优化芦丁含量测定条件.食品科技,2012,37(12):228-231.