基因工程研究PPT课件.ppt

基因工程研究体外操作与细胞内表达(基因工程技术包括下列过程)
分─获取目的基因和载体
接─目的基因与载体的连接
转─重组DNA导入宿主细胞
筛─重组DNA的筛选
鉴─重组DNA的鉴定
可用以上五个字表示(一)目的基因的分离(分)2、基因分离的注意事项
(1)以基因表达产物蛋白质的纯化或表型突变体的分离;
(2)通过植物细胞工程、物理和化学诱变等技术,获得植物基因;
(3)可在cDNA文库中随机取一个克隆;
(5)采用染色体步移(chromosomalwalking)方法分离基因出来;
(6)许多植物基因可以根据其与细菌和酵母突变互补能力来分离;
(7)许多有潜在利用价值的植物基因。(二)目的基因的制备根据已知多肽链的氨基酸顺序,利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于合成小分子多肽的基因
全基因合成:合成40-60bp片段,再连接
合成思路
基因的半合成:合成末端间有10-14bp个互补碱基的
片段,再利用DNA聚合酶催化合成
目前,常用DNA自动合成仪合成。重叠区2、基因组文库(GenomicDNALibrary)
基因组文库(genelibrary):是指汇集某一基因组所有DNA序列的重组DNA群体
从生物组织细胞提取出基因组DNA,用限制性酶法将DNA降解成预期大小的片段,并电泳分离,然后将这些片段与适当的载体(噬菌体)体外重组,进行体外包装系统将重组体包装成完整颗粒,转入受体细菌(大肠杆菌),形成大量噬菌斑,从而形成整个基因组DNA的重组DNA克隆群体,称为基因组DNA文库。
具备了基因组文库,就可以用目的基因片段作探针,利用菌落原位杂交技术,从大量的菌落中筛选出含有目的基因的重组体的菌落,再经过扩增,提取其中的重组体,最后即可获得所需要的目的基因片段。基因组DNA文库法示意图3、cDNA文库法导入宿主细胞克隆,构建cDNA文库(三)聚合酶链反应(PCR)二、目的基因与载体的重组(接)
(一)质粒DNA的分离和纯化
(二)目的基因与载体的连接
1、粘性末端连接
2、平头末端连接
3、人工接头法
4、同源多聚尾连接法
(一)质粒DNA的分离和纯化1、粘性末端连接
将目的基因和载体用同一种限制酶酶切,产生相同粘性末端,再通过DNA连接酶作用将两者连接起来,构成重组DNA分子。
2、平头末端连接
某些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端,此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。基因和载体用同一种限制酶酶切(粘性末端连接)3、人工接头法
人工接头是合成的寡核苷酸,在其上人为地安置了限制性内切酶的识别序列。将人工接头连接到载体和目的基因上,即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断,得到可以互补的粘性末端。4、同源多聚尾连接法同源多聚尾连接法三、将重组体导入受体细胞(转)50-100mmol/L
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤几个概念:2、转导(transduction)
将重组的λ噬菌体DNA或柯斯质粒DNA体外包装成具有感染能力的λ噬菌体颗粒,然后经受体细胞表面的λ噬菌体接受器位点使这些重组体DNA注人大肠杆菌宿主细胞。

转染的效率较低,在基因工程中,λ噬菌体DNA等的直接转染并不常用。因此,常用λDNA体外包装技术。即首先将λ噬菌体DNA或柯斯质粒DNA体外包装成具有感染能力的λ噬菌体颗粒,然后再以其转导受体细胞基因重组λ噬菌体体外包装的基本原理:

λ噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部,而尾部基因发生了突变的噬菌体只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体提取物混合起来就能在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。

一般只要为重组DNA提供高浓度的噬菌体前体,包括包装蛋白、头部、尾部,就有可能形成完整的噬菌体颗粒。
λ噬菌体头部外壳蛋白包装DNA的容量控制在野生型λDNA长度的75％一105％。(二)酵母转化法2、原生质体转化法
酵母细胞经过用适当水解酶酶解消化细胞壁等处理后,也像大肠杆菌一样能够接受外源DNA重组体的导入。
操作方法:
该法首先利用蜗牛酶处理对数生长期的酵母细胞,然后将经酶解去除了细胞壁的原生质体悬浮于山梨醇及氯化钙的溶液中,在运载DNA的存在下,用聚乙二醇使重组DNA分子进入酵母细胞。(三)植物细胞转化法crowngallortumor一般流程如下:
根癌农杆菌的培养、纯化→根癌农杆菌工程菌侵染液的制备→植物外植体的预培养→将根癌农杆菌工程菌接种到植物外植体的损伤切面→植物外植体与根癌农杆菌的共培养→植物外植体的脱菌培养→转化体的选择培养。农杆菌的活化挑单克隆进行
培养、纯化收集细胞将预培养的外植体放入菌液中共培养共培养在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化,
形成转化芽(脱菌培养)转化体的诱导芽生长生根,形成转化植株2、基因枪法台