基因工程制药PPT课件.ppt

基因工程制药一、基因的概念:
DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。
早期认为遗传物质是蛋白质，1944年Avery从肺炎链球菌转化实验证明是DNA。（一）、DNA的复制：
半保留复制二、基因表达第二章基因工程制药1-4节20世纪70年代基因工程诞生最先应用在医药科学领域。
1982年第一个基因工程产品--人胰岛素在美国问世。
优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足。基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。基因工程基本过程⒈目的基因的克隆，
⒉构建DNA重组体，
⒊DNA重组体转入宿主菌，
⒋构建工程菌，
⒌工程菌发酵，
⒍表达产物的分离纯化，
⒎产品的检验等。基因工程药物制药的主要程序克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。
一、逆转录法
逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，在反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。⒈mRNA的纯化
⒉cDNA第一链的合成
⒊cDNA第二链的合成
⒋cDNA的克隆
⒌将重组体导入宿主细胞
⒍cDNA文库的鉴定
⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定二、化学合成法人工化学合成基因的限制筛选基因的其他方法第四节基因表达最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。
多种
如果肺炎的诊断成立，评价病情的严重程度、肺部炎症的播散和全身炎症反应程度。除此之外患者如有下列危险因素会增加肺炎的严重程度和死亡危险：
（一）病史年龄>65岁；存在基础疾病或相关因素，如慢性阻塞性肺疾病（COPD）、糖尿病、慢性心、肾功能不全、慢性肝病、一年内住过院、疑有误吸、神志异常、脾切除术后状态、长期嗜酒或营养不良。
（二）体佂呼吸频率>30次/分；脉搏≥120次/分；血压<90/60mmHg;体温≥40℃或≤35℃；意识障碍；存在肺外感染病灶如脑膜炎，甚至败血症（感染中毒症）。
（三）实验室和影像学异常血白细胞计数>20X109/L；呼吸空气时动脉血氧分压（PaCO2）>50mmHg;血肌酐>106umol/L或血尿素氮>7.1mmol/L；血红蛋白<90g/L或血红细胞比容<0.30；血浆白蛋白25g/L；感染中毒症或弥散性血管内凝血的证据，如血培养阳性、代谢性酸中毒、凝血酶原时间和部分激活的凝血活酶时间延长、血小板减少；X线胸片病变累及一个肺叶以上、出现空洞、病灶迅速扩散或出现胸腔积液。
重症肺炎目前还没有普遍认同的标准，如果肺炎患者需要呼吸支持(急性呼吸衰竭、气体交换恶化伴高碳酸血症或持续低氧血症)、循环支持(血流动力学障碍、外周低灌注)和需要加强监护和治疗(肺炎引起的感染中毒症或基础疾病所致的其他器官功能障碍)可认为重症肺炎。目前许多国家制定了重症肺炎的诊断标准，虽然有所不同，但均注重肺部病变的范围、器官灌注和氧合状态。
我国制定的重症肺炎标一、宿主细胞的选择发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；
容易进行代谢调控；
容易进行DNA重组技术操作；
产物的产量、产率高，
产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类：
第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；
第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
⒈原核细胞因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
蛋白质不能糖基化。
产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。
其内毒素很难除去。⒉真核细胞目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母,已建立了许多适合它们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。二、大肠杆菌中的基因表达⑸应具有很强的终止子，只转录
克隆的基因，所产生的mRNA较为
稳定。
⑹所产生的mRNA必须具有翻译的
起始信号AUG和SD序列，以便转录
后顺利翻译。
常用表达载体--质粒pBV220的结构融合表达质粒pBG-2的结构⒉影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素⒊真核基因在大肠杆菌中的表达形式⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因
非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。
优点：保持原有蛋白活性；
缺点：易被蛋白酶破坏。⑶分泌型表达药物基因
优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸残基；
缺点：产量不高，信号肽不被切割。
三、酵母中的基因表达⑴载体的复制系列可分四类：
①Yep类（yeastepisomalplasmid，
酵母附加体质粒）
②YRp类（yeastreplicationplasmid，
酵母复制型质粒）
③YCp类（yeastcentromericplasmid，
酵母着丝粒质粒）
④YIp