实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌ppt课件.ppt

实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌实验目的实验原理转化(Transformation)
是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
0.1mol/LCaCl2是一种低渗溶液，在0℃低温处理大肠杆菌细胞时，细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击（如42℃）下，细胞可吸收外源DNA。
为了鉴定这些转化子，须利用质粒编码的筛选标记，这些标记赋予细菌新的表型，是成功转化的细菌很容易被筛选出来。pET32a质粒带有氨苄西林抗性基因（Ampr），其重组体转化的大肠杆菌能够在含氨苄西林的培养基上生长，而未转化的受体菌则不能再这种培养基上生长。Ampr：氨苄西林抗性基因–β内酰胺酶结构的三大要素：
多克隆位点
选择标记（耐药性，LacZ）
复制起始位点
种类：
质粒
噬菌体
酵母人工染色体（YAC）
反转录病毒载体
表达载体等‹#›pET-32aVectorpET-32cloning/expressionregion材料、设备及试剂试剂1、LB固体和液体培养基
LB培养基配方：（单位g/L）
胰蛋白胨 10
酵母提取物 5
NaCl 10
琼脂粉（1.5%）15g（注：LB液体培养基不加琼脂粉）
按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。121℃湿热高压灭菌20分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作台中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养皿铺板。2、Amp母液：
称取氨苄西林100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤器过滤除菌，用1.5ml离心管分装后储存于-20℃冰箱.
3、0.1mol/LCaCl2溶液:
称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0.22μm滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于4℃冰箱储存.
4、pET32a-SmPR10质粒：实验室自制操作步骤（二）、感受态细胞的制备(CaCl2法)
1、将菌液转入1.5ml离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃、4000rpm离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰上放置10分钟后,4℃、4000rpm离心10分钟。
3、弃去上清,加入0.1ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞。每份100μl（注意悬液密度要均匀）,冰上放置备用。
4、暂时不用的感受态细胞可置于-80℃保存。（三）重组质粒DNA的转化
质粒和感受态细胞混和：在100μl感受态细胞悬液中加入5μl重组质粒DNA（pET32a-SmPR10），轻轻混匀后冰上放置30分钟。
热击：42℃水浴中热击60秒（注：精确计算时间，热击过长将对细胞造成伤害）,热击后马上置于冰上冷2-5分钟。
复苏：向每管中加入800μlLB液体培养基(注：不含Amp),混匀后在37℃150rpm轻摇培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。（四）涂布平板筛选转化质粒

将管中培养液摇匀后取100μl均匀涂布于含Amp的筛选平板上。
（注：将培养液摇匀后涂布。）
2.正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃温箱中培养过夜，次日观察实验结果。预期实验结果实验报告实验中要考虑的重要因素2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。10ng的cccDNA即可使100μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3.试剂的质量:所用的试剂，如CaCl2等均需是高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
4.防止杂菌和杂DNA的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
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