基因组序列诠释ppt课件.ppt

第五章基因组序列诠释问题1.寻找基因Kozak规则:

若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下：

(1)第4位的偏好碱基为G；
(2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T；
(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基；
(4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。信号肽分析软件
(SignalPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/signalP)

把预测过程中证实含完整mRNA5’端的序列翻译为蛋白序列;
然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列(从第一个ATG对应的甲硫氨酸Met开始)进行评估，如果SignalP分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽;⑶终止密码子⑷3’端的确认⑸非编码序列、内含子编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。
不同种属间使用同义密码的频率有很大差异：
如人类基因中，
丙氨酸（Ale）密码子多为GCA,GCC或GCT,而GCG很少
苏氨酸（Thr）密码子多为ACA,ACC或ACT,而ACG很少⑺密码子偏爱性⑻外显子－内含子边界⑼上游控制序列⑽内含子和外显子序列差异⑾软件预测

采用NCBI的ORF预测软件(ORFfinder:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)判断ORF的可能范围。基因注释软件基因注释软件缺点1.2同源查询途径

通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询。
相似性有如下几种情况：

ADNA序列某些片段完全相同；
B开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子；
C开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性；
D模拟多肽高级结构相似同源性：homology起源于同一祖先但序列已经发生变异的序列，分布在不同物种间的同源基因，只有是与非的区别。分子杂交可确定DNA片段是否含有表达顺序
Northernblot：指将待测DNA样品标记后与RNA杂交，以判断RNA中是否含有DNA的转录产物。但在操作中存在一些问题1977年J.C.Alwin首创Northernblotting问题23心肌特异性蛋白问题问题C基因表达产物丰度的问题28DNA顺序中基因位置的确定
cDNA测序受两个方面的影响：
一是相关cDNA在cDNA文库中出现的频率；
二是cDNA的完整性如何获取基因全长cDNA序列？干扰cDNA筛选基因的因素：
目标cDNA所占比例很低
分成亚群进行筛选
cDNA均一化
影响cDNA测序的因素与mRNA的反转录有关
cDNA文库构建(CLONTECH)cDNA文库构建(CLONTECH)5’RACE
(CLONTECH)3’RACE
(CLONTECH)确定DNA顺序中基因的位置利用计算机分析基因功能2.1同源性确定基因功能同源基因一般不会有完全一致的核苷酸序列，因为不同的基因或不同的生物都会独立地发生随机突变，但它们有相似的序列，大部分未突变的核苷酸位置是相同的同源性分析可以给出整个基因或其中某一区段功能的有关信息2.2同源性分析在酵母基因组计划中的应用3.1基因失活在基因功能分析的作用

3.2基因的超表达用于功能检测3.1.1基因剔除(knock-out)
最简便的基因失活的方法.

主要原理:
在一段无关DNA片段的两侧连接与代换基因两侧相同的顺序，将这一构建导入目的细胞，由于同源片段之间的重组，可使无关片段取代靶基因,整合到染色体中。为了便于筛选，用于取代的外源DNA中含有报告基因。tk胸苷激酶标记基因←gangcyclovir
neor新霉素抗性基因→G418443.1.2反义RNA构建反义RNA表达载体:

将全目的基因或部分目的基因反向插入表达载体→转化目标生物→获得转基因个体或品系→分析转基因植株在生理、生化、形态等方面的变异→判别目的基因的功能正义表达载体反义RNA作用机理：

A干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始顺序及编码序列结合形成双链RNA，随之被细胞降解。
B与mRNA的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，使翻译无法启动。
C反义RNA与mRNA形成双链分子后，使RNA多聚酶脱离模板，转录终止。3.1.3RNA干涉RNAi作用机理51RNAi设计方法及应用

AFraser合成与开放读码框相对应的双链RNA或利用细菌克隆表达这些双链RNA→微量注射和喂食→干扰同源基因的表达
BChuang等设计出嵌合体结构→连接强启动子大量表达双链mRNA→干扰同源基因的表达HbF基因的RNAi载体构建RNAi技术的优缺点3.2基因超表达
构建转座子突变库

酵母双杂交（yeasttwo-hybridization