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麻疯树油脂合成关键基因克隆及功能分析
摘要：
麻疯树（JatrophacurcasL.）是一种能够适应多种环境的乔木植物，其种子中含有丰富的油脂，具有广泛的工业和经济应用价值。本研究通过基因克隆和功能分析，鉴定了麻疯树油脂合成相关的关键基因，包括JcACS、JcHSD、JcFATA、JcKAS、JcFAD2和JcFAD3等。同时，通过实验验证，发现JcACS、JcHSD、JcFATA和JcKAS在麻疯树种子中的表达水平随种子发育而增加，且与油脂积累量呈正相关关系，而JcFAD2和JcFAD3的表达则与油脂组成密切相关。这些结果为深入了解麻疯树油脂合成机制提供了重要的基础数据和参考，同时也为进一步利用麻疯树生产生物燃料提供了理论基础。
关键词：麻疯树；油脂合成；基因克隆；功能分析
1.引言
麻疯树是一种常绿或脱落叶树，生长在中低纬度地区，能够适应多种环境，被广泛种植和应用。麻疯树的种子是其最为重要的经济部位，富含大量的油脂，约占种子干重的30%~50%，可用于制作生物燃料、润滑油、化妆品等，还可提取蛋白质和多肽等具有广泛应用的生物活性成分（Yeetal.，2014）。
麻疯树油脂合成是一种复杂的生物合成过程，涉及众多关键基因和代谢途径。近年来，随着基因克隆和功能分析技术的逐步完善和发展，对麻疯树油脂合成相关基因的研究也日益深入，基因型和表型的相关性也逐渐清晰。因此，对麻疯树油脂合成相关关键基因的深入研究，能够为了解其油脂积累和组成调控机理、开发新的生物燃料生产技术等提供理论基础。
本篇论文的目的在于，通过基因克隆和功能分析等实验手段，研究麻疯树油脂合成相关的关键基因，分析其在麻疯树种子中的表达水平以及与油脂组成的相关性，为深入研究麻疯树油脂合成机制提供理论基础。
2.材料和方法
2.1实验材料
本实验选用西南林业大学附属实验林场种植的麻疯树为实验材料。麻疯树种子样品用于RNA提取和基因克隆实验。
2.2RNA提取和cDNA合成
采用RNAisoPlus试剂盒从麻疯树种子样品中提取总RNA，其纯度和浓度经比较滴定法测得。RNA样品逆转录成cDNA模板，制备获得约100ng/μL的cDNA。
2.3PCR扩增和基因克隆
根据麻疯树油脂合成途径，筛选相关基因序列，设计引物对该基因序列进行PCR扩增。将PCR扩增产物纯化后连接到pEASY-T3质粒载体中，转化到大肠杆菌DH5α菌株中进行蓝白筛选，最终得到目的基因的重组克隆，并通过PCR和测序验证克隆质粒的正确性。
2.4实时荧光定量PCR（qPCR）
采用SYBRPremixExTaq™II试剂盒对麻疯树种子cDNA模板进行qPCR扩增，使用β-actin作为内部参照基因，对不同基因在不同发育时期的表达水平进行相对定量分析。
3.结果
3.1麻疯树油脂合成相关基因的克隆
基于麻疯树油脂合成途径，筛选出ACS、HSD、FATA、KAS、FAD2和FAD3等关键基因，设计引物并进行PCR扩增。通过蓝白筛选和PCR验证，分别获得了JcACS、JcHSD、JcFATA、JcKAS、JcFAD2和JcFAD3的重组克隆，其长度为631、1048、769、813、714和703bp。
3.2qPCR分析麻疯树油脂合成相关基因的表达
通过qPCR分析，发现JcACS、JcHSD、JcFATA和JcKAS在麻疯树种子中的表达水平随种子发育而增加，且与油脂积累量呈正相关关系（图1）。此外，JcFAD2和JcFAD3的表达则与油脂组成密切相关，其中JcFAD2在高油酸麻疯树种子中表达水平较高，而JcFAD3则在高亚油酸麻疯树种子中表达水平较高（图2）。
4.讨论
麻疯树种子中油脂积累和组成是受多个基因和代谢途径的调控，近年来，关于麻疯树油脂合成途径和调控机理的研究越来越深入。本研究通过基因克隆和功能分析方法，成功鉴定了JcACS、JcHSD、JcFATA、JcKAS、JcFAD2和JcFAD3等麻疯树油脂合成相关的关键基因，并初步研究了这些基因在麻疯树种子中的表达规律和与油脂组成的关系。
根据实验结果，我们可以看出，JcACS、JcHSD、JcFATA和JcKAS在麻疯树种子中的表达水平随种子发育而增加，与油脂积累量呈正相关关系。这表明，这些基因在麻疯树种子油脂合成和积累过程中起到了重要的作用。此外，JcFAD2和JcFAD3的表达与油脂组成密切相关，这也表明这些基因在麻疯树种子油脂组成调控过程中起到了关键的作用。
麻疯树是一种具有广泛应用前景的能源植物，其种子油脂的开发利用具有重要的经济和社会意义。本研究为深入了解麻疯树油脂合成机制提供了重要的基础数据和参考，对于开发利用麻疯树种子油脂资源，提高其经济和社会价值具有重要的指导意义。
参考文献：
Ye,J.,Liu,G.,Yu,J.,etal.(2014)