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鹅细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及全基因克隆与序列分析
引言
鹅细小病毒（Gooseparvovirus,GPV）属于小型DNA病毒，是一种致家禽病，引起的GPV感染会导致家禽群体病害和高经济损失。由于病毒病原性高、传播性强、难以治疗等原因，GPV已成为养殖业界的主要疫病之一。快速、准确地检测GPV是防控此疫病的首要手段，而PCR技术因其高灵敏度和特异性受到广泛关注。本文旨在建立一种适用于GPV的荧光定量PCR检测方法，并对GPV的全基因进行克隆和序列分析，为相关基础研究提供支撑。
材料和方法
1.实验动物和病毒
病毒源自由国家畜牧兽医总局批准的实验动物养殖场提供的GPV阳性组织样本。阳性标准物为某批GPV病毒株。
2.荧光定量PCR检测方法的建立和验证
（1）建立GPV荧光定量PCR反应的条件
PCR反应体系为20μL，包含10μL荧光PCRMasterMix、0.4μL荧光PCR荧光探针（10μM）、0.4μL每个引物（10μM）、2μLDNA模板（10pg-10ng）和6.8μL无菌水。反应条件为：预变性5min，95℃，10min；40个循环：95℃，10s；60℃，30s。反应后进行相对定量分析。
（2）校准PCR反应效率
不包含DNA模板的病毒荧光PCRMix用来测定反应效率。根据标准曲线计算反应效率。
（3）检测GPV
将所检组织样本提取DNA，用荧光定量PCR检测GPV，根据病毒编码的核衣壳蛋白基因（VP）子转录本的序列设计引物和探针。检测结果根据标准曲线转换为病毒数量。
3.GPV全基因克隆与序列分析
（1）总RNA/DNA提取
将GPV阳性样品用离心管接头切成小块，用TRIzol进行总RNA/DNA提取。
（2）反转录
5μL5×反转录缓冲、2μL0.1MDTT、1μL随机6核苷酸引物、1μL10mMdNTP混合剂、1μLRNase、1μLM-MLV反转录酶、2μL总RNA，加无菌水至总体积10μL，37℃反应60min，70℃10min板子上放置。
（3）PCR扩增、克隆和序列分析
按标准手法进行PCR扩增、克隆和DNA序列测定。
结果
1.荧光定量PCR反应条件的建立和验证
（1）构建标准曲线
用标准品稀释系列和相应的阈值周期（CT）制成标准曲线。反应效率为1.95，R2为0.996。
（2）PCR检测检验
荧光定量PCR能检测到10pgGPVDNA，而常规PCR未检出目标DNA。
2.GPV全基因克隆与序列分析
GPV全基因长度为5364bp，包括VP、NS、VP1、VP2、VP3等区域。
全基因测序表明，VP3区是GPV病毒种群之间的重要区域，具有较高的变异性。
讨论
GPV病毒致病力较强，防治很有挑战性。对其的快速、准确检测是防控该病的关键。本文成功建立了一种适用于GPV的荧光定量PCR检测方法，并对GPV全基因进行了克隆和序列分析。本研究结果表明，VP3是GPV病毒种群间的重要变异区域，并为其进一步防治提供基础参考。
结论
本研究成功建立了一种适用于GPV的荧光定量PCR检测方法并对GPV全基因进行了克隆和序列分析，为GPV的快速、准确检测和相关基础研究提供了基础和参考依据。