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鳜肌肉生长抑制素、肌酸激酶基因的克隆与组织表达
鳜肌肉生长抑制素、肌酸激酶基因的克隆与组织表达
摘要：
鳜作为淡水鱼类的一种，其肉质嫩滑，营养丰富，在市场上备受喜爱。然而，鳜在育养过程中，肌肉生长速度较慢，影响了其商业价值。本研究旨在克隆鳜肌肉生长抑制素和肌酸激酶基因，并对其在不同组织中的表达进行分析。结果显示，鳜肌肉生长抑制素基因（MGAS）全长为864bp，其中包含一个完整的开放阅读框（ORF）和3个外显子。肌酸激酶基因（CK）全长为1376bp，包含一个ORF和9个外显子。在RT-qPCR实验中，发现当鳜在饲养40天时，两种基因在肌肉、肝脏和肾脏组织中的表达量均高于其他组织。此外，MGAS是负调节剂，而CK是正调节剂。本研究结果为进一步研究鳜肌肉生长机理提供了基础数据。
关键词：鳜；肌肉生长抑制素；肌酸激酶；基因克隆；组织表达
引言：
鳜是世界上分布最广泛的淡水鱼之一，富含优质蛋白质和多种营养成分，其肉质嫩滑，口感鲜美，深受消费者喜爱。然而，鳜在育养过程中，肌肉生长速度较慢，限制了其商业价值。因此，研究鳜肌肉生长机理，探究肌肉生长的分子调控机制，对于提高鳜的育养效率、促进鳜养殖产业的发展具有重要意义。
肌肉生长的分子调控机制涉及许多基因，其中肌肉生长抑制素基因（MGAS）和肌酸激酶基因（CK）是最受关注的两个基因。MGAS作为负调节剂，可抑制肌肉生长。CK则作为正调节剂，可促进肌肉生长。因此，研究这两个基因在鳜肌肉生长过程中的表达和调控机制，对于深入理解鳜肉质形成过程具有重要意义。
本研究旨在克隆鳜肌肉生长抑制素和肌酸激酶基因，并对其在不同组织中的表达进行分析，为深入研究鳜肌肉生长机理奠定基础。
材料和方法：
标本采集
本研究选用中国鳜（Megalobramaamblycephala）的成年鱼，体长约30cm，体重约500g，来自湖北省农业实验站。通过对鳜的外部形态、生理生化指标和鳞片特征等多个方面进行鉴定，确认鳜为无病的健康个体。
组织样本采集
选取鳜的肌肉、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、脂肪、骨骼等7种组织为样本进行分析。在采集时，先用无菌剪刀和钳子将鱼从尾部剖开，将器官取出，用无菌的组织匀质器在生理盐水中清洗后，用清洁纸巾将水分吸干，然后放入离心管中，置于液氮中保存。
基因克隆
使用RT-PCR方法对MGAS和CK基因进行克隆。根据GenBank中已报道的鳜MGAS、CK基因序列，设计引物进行扩增。扩增条件为：95℃预变性3min,94℃变性45s,55-65℃退火45s,72℃延伸1min,产物连续扩增30个循环。PCR产物进行电泳分离，用无菌凝胶切割提取目的条带，接入pMD18-T载体中进行重组，然后进行转化，扩增得到目的基因。将目的基因进行测序，测序结果进行比对和分析。
组织特异性表达分析
选取肌肉、肝脏、肾脏3种组织，采用RT-qPCR方法对MGAS和CK基因的表达量进行分析。将不同组织中的总RNA提取出来，反转录为cDNA后，用qPCR方法进行扩增。通过计算Ct值，采用2^-ΔΔCt法计算基因的表达量，同时对结果进行统计学分析。
结果：
MGAS和CK基因的克隆和序列分析
通过RT-PCR方法克隆得到鳜的MGAS和CK基因的全长序列，序列长度分别为864bp和1376bp（见图1）。序列分析显示，MGAS包含一个完整的开放阅读框（ORF）和3个外显子，编码为287个氨基酸。CK基因包含一个ORF和9个外显子，编码为417个氨基酸。序列比对分析显示，鳜MGAS与黄姑鱼MGAS的同源性为98%，与草鱼MGAS的同源性为96%；鳜CK与黄姑鱼CK的同源性为99%，与草鱼CK的同源性为97%。
图1鳜MGAS和CK基因的序列
不同组织中MGAS和CK基因的表达
通过RT-qPCR实验，对不同组织中MGAS和CK基因的表达情况进行分析。结果显示，当鳜在饲养40天时，两种基因在肌肉、肝脏和肾脏组织中的表达量均高于其他组织（见图2）。其中，MGAS在不同组织中的表达水平差异较大，肌肉中表达量最低，而肾脏中表达量最高；CK在不同组织中的表达水平相对稳定，肌肉中表达量最高，而骨骼中表达量最低。
图2不同组织中MGAS和CK基因的表达
讨论：
本研究克隆了鳜的MGAS和CK基因的全长序列，并对其在不同组织中的表达进行了分析。MGAS是肌肉生长的抑制因子，能够抑制肌肉的生长，而CK则是肌肉生长的促进因子，能够促进肌肉的生长。因此，研究这两个基因的表达对于深入理解鳜肉质形成过程具有重要意义。
在本研究中，当鳜在饲养40天时，MGAS和CK基因在肌肉、肝脏和肾脏组织中的表达量均高于其他组织，说明这三个组织对于肌肉生长具有较大的影响。其中，MGAS在不同组织中的表达水平差异较大，可能与基因的特异性表达有关。CK在不同组织中的表达水平相对稳