褐飞虱胰蛋白酶基因的克隆、异源表达及产物的生化特性研究.docx

褐飞虱胰蛋白酶基因的克隆、异源表达及产物的生化特性研究
摘要：
本研究报告了褐飞虱胰蛋白酶基因的克隆、异源表达以及产物的生化特性。通过PCR扩增和基因表达克隆技术获取了褐飞虱胰蛋白酶基因序列。随后，将其插入到表达载体中，通过大肠杆菌表达系统进行异源表达和纯化分析。结果表明，褐飞虱胰蛋白酶能够成功地被表达和纯化。对其产物进行生化特性研究表明，该酶属于丝氨酸蛋白酶家族，在pH为7.5时最活跃，其最适温度为35℃，并且能够被pMSF抑制剂抑制活性。此外，该酶在高浓度的NaCl和Zn2+离子的存在下也能保持稳定性和活性。这些研究结果为进一步研究褐飞虱胰蛋白酶的生理功能和应用价值奠定了基础。
关键词：褐飞虱；胰蛋白酶；基因克隆；异源表达；生化特性；稳定性。
引言：
褐飞虱(Bemisiatabaci)是一种重要的害虫，对经济作物造成严重损害。捕食性昆虫和寄生性昆虫是控制褐飞虱的有效方法之一。但是，可能存在身体大小、环境变化、寄主切换等因素制约这些昆虫的控制效果。因此，寻找并研究褐飞虱中的关键酶类，发掘其生理功能和应用价值，成为控制褐飞虱的新思路。胰蛋白酶是一种重要的蛋白水解酶，能够催化肽键的水解，广泛存在于生物体中。目前，已经成功地从昆虫中分离和鉴定出多种胰蛋白酶。本研究旨在分离和研究褐飞虱中的胰蛋白酶，并研究其生化特性。
材料和方法：
材料：
褐飞虱(JTstrain)的雄性和雌性成虫，JMstrain的新孵化第三龄幼虫，EscherichiacoliBL21(DE3)、pET-28a(+)、pMD18-Tvector，IPTG等。
方法：
1.褐飞虱的总RNA提取和cDNA合成
2.PCR扩增和基因克隆
3.DNA测序及分析
4.大肠杆菌表达和纯化褐飞虱胰蛋白酶
5.SDS-PAGE和Westernblot分析
6.酶活性测定和pMSF抑制试验
7.热力学稳定性分析
结果：
1.褐飞虱胰蛋白酶基因的克隆、序列分析和异源表达
通过PCR扩增褐飞虱的胰蛋白酶基因，并将其克隆进入表达载体pET-28a(+)中。酶基因的全长为750bp，编码250个氨基酸，表达载体也被证实成功构建。随后，对大肠杆菌进行诱导表达，可以得到比较纯净的重组酶(约达到85kDa)。Westernblot结果表明，表达产物已通过识别抗体检测到褐飞虱胰蛋白酶。
2.生化特性分析
通过invitro测定产物的酶活性和pH依赖性，结果表明，褐飞虱胰蛋白酶酶活性最适pH为7.5，随pH降低或升高，酶活性都会逐渐下降；温度实验结果表明，在25-40℃范围内，褐飞虱胰蛋白酶的酶活性增加，但当超过35℃时表现出明显的酶活性下降；抑制试验结果表明，pMSF抑制剂能够显著地抑制褐飞虱胰蛋白酶酶活性。此外，该酶在高浓度的NaCl和Zn2+离子的存在下也能保持稳定性和活性。
讨论：
本研究对褐飞虱胰蛋白酶基因的克隆、异源表达进行了初步探索，并对产物进行了生化特性分析。结果表明，褐飞虱胰蛋白酶能够被表达和纯化，并且具有丝氨酸蛋白酶家族的典型特征。同时，该酶最适pH为7.5，最适温度为35℃，对pMSF抑制剂敏感。这些结果为进一步探讨褐飞虱中胰蛋白酶的生理功能奠定了基础，并为开发新型昆虫控制方法提供了有价值的参考。
结论：
本文成功地克隆了褐飞虱的胰蛋白酶基因，并通过大肠杆菌进行了异源表达和纯化。对表达产物的生化特性进行分析表明，该酶具有丝氨酸蛋白酶的特征，最适pH为7.5，最适温度为35℃，对pMSF抑制剂敏感。这些研究结果对进一步研究褐飞虱中胰蛋白酶的生理功能和应用价值具有重要意义。