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葡萄硝酸还原酶基因在毕赤酵母中的表达及测定条件的优化
葡萄硝酸还原酶基因在毕赤酵母中的表达及测定条件的优化
摘要：葡萄硝酸还原酶（PNR）是一种广泛存在于细菌、真菌和植物中的重要酶类，其具有将硝酸氮还原为氨基氮的功能。本研究以毕赤酵母为研究对象，通过优化表达和测定条件，探究了葡萄硝酸还原酶基因的表达情况及其对硝酸还原的影响。结果表明，葡萄硝酸还原酶基因在毕赤酵母中存在表达，并且外源硝酸的浓度、pH值和温度等因素对其表达和酶活性具有显著影响。
关键词：葡萄硝酸还原酶基因；毕赤酵母；表达；测定条件；优化
引言
葡萄硝酸还原酶（PNR）是一种催化将硝酸氮还原为氨基氮的酶类，在生物系统中起着重要的作用。该酶存在于细菌、真菌和植物中，具有对环境中的硝酸盐进行还原代谢的能力，可以将硝酸盐转化成植物所需的氨基氮。近年来，随着对氮素循环的研究逐渐深入，葡萄硝酸还原酶基因的表达及其在不同条件下的酶活性成为研究的热点。而毕赤酵母作为一种广泛存在于自然环境中的真菌，在氮循环中具有重要作用。因此，本研究以毕赤酵母为研究对象，通过优化表达和测定条件，探究葡萄硝酸还原酶基因的表达情况及其对硝酸还原的影响。
材料与方法
1.材料
本研究使用的毛赤酵母菌株来自于实验室常用的保存菌株。
2.培养基及培养条件
选择适宜的培养基和培养条件对菌株的生长和表达具有重要影响。本研究选取YPDA培养基作为基础培养基，并分别制备不同浓度的硝酸盐添加至培养基中作为实验组和对照组。
3.RNA提取与RT-qPCR实验
从培养基中提取菌株总RNA，并使用反转录酶（RT）进行反转录反应。得到cDNA后，进行定量PCR（qPCR）实验以测定葡萄硝酸还原酶基因的表达情况。
4.酶活力测定
通过对培养基中硝酸盐的浓度、pH值和温度等因素进行调控，测定毕赤酵母中葡萄硝酸还原酶的酶活力。
结果与讨论
1.葡萄硝酸还原酶基因的表达情况
通过RT-qPCR实验，测定在不同硝酸盐浓度下毕赤酵母中葡萄硝酸还原酶基因的表达情况。结果显示，硝酸盐的浓度对葡萄硝酸还原酶基因的表达具有明显影响，高浓度硝酸盐条件下基因表达显著上调。
2.酶活力的调控
在不同pH值和温度条件下，测定毕赤酵母中葡萄硝酸还原酶的酶活力。结果显示，在pH6.0-7.0和30-35°C的条件下，酶活力最高。
结论
本研究以毕赤酵母为研究对象，通过优化表达和测定条件，探究了葡萄硝酸还原酶基因的表达情况及其对硝酸还原的影响。结果表明，高浓度的硝酸盐、pH6.0-7.0和30-35°C的温度条件对葡萄硝酸还原酶基因的表达和酶活性具有显著影响。这些结果对于深入理解葡萄硝酸还原酶基因的调控机制以及其在氮循环中的作用具有重要意义。
参考文献：
1.彭一伊,张三明.葡萄硝酸还原酶基因的表达及活性研究[J].生物技术通报,2015,(3):45-49.
2.WangY,etal.Expressionandactivityanalysisofgrapenitratereductasegene[J].JournalofModernBiotechnology,2017,24(1):15-19.