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藤稔葡萄花发育相关基因的克隆及表达分析
摘要：
藤稔葡萄作为一种重要的经济作物，其花的发育过程受到多种基因的调控。本研究对藤稔葡萄花发育相关基因进行了克隆和表达分析。通过RT-PCR技术，筛选出了10个与花发育相关的基因，并对其进行了序列分析和进化关系推断。结果表明，这些基因具有不同程度的保守性和异质性。在表达分析方面，我们发现这些基因在不同的花发育阶段中呈现出差异的表达模式，表明它们在花发育中具有不同的作用。本研究结果对了解藤稔葡萄花发育的分子机制具有重要的意义。
关键词：藤稔葡萄，克隆，表达分析，花发育，基因
1.引言
藤稔葡萄（VitisviniferaL.）作为一种常见的葡萄品种，其果实中含有丰富的多酚类物质和多种生物活性物质，被广泛应用于食品、饮料、药品等领域。花作为果实的前身，在葡萄生长过程中起着重要的作用。然而，不同基因的表达调控是花发育的关键因素。因此，研究藤稔葡萄花发育相关基因的克隆和表达分析，对于深入了解花发育的分子机制具有重要意义。
2.材料与方法
2.1花材料采集与RNA提取
采集不同花发育阶段的藤稔葡萄花，包括花芽（FB）、萼片分离（S）、花瓣四分之一张开（Q）、花瓣半张开（H）和完全开放（F）等五个发育阶段。用Trizol试剂提取总RNA，经过质量检测后，采用DNaseI消化残余DNA，用oligo(dT)15为引物，利用ReverseTranscriptaseM-MLV翻转录为cDNA。
2.2克隆花发育相关基因
设计引物并使用RT-PCR技术，克隆与藤稔葡萄花发育相关的基因。PCR反应体系为：1μL模板DNA，1μL引物，12.5μL2×TaqPlusMasterMix（含有Taq酶，dNTPs等），9.5μLdH2O。PCR反应程序为：95℃预变性5min,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,总扩增周期数为30。PCR产物进行电泳检测，目的片段进行序列鉴定。
2.3序列分析和进化关系推断
使用ClustalW软件进行多序列比对，PhyML软件对比对结果进行进化关系推断。通过MEGA5.1软件进行最大似然(MP)方法构建系统演化树。
2.4RT-PCR测定基因表达差异
设计RT-PCR引物，检测不同花发育阶段下，克隆基因的表达差异。PCR反应体系为：1μLcDNA，1μL引物，12.5μL2×TaqPlusMasterMix（含有Taq酶，dNTPs等），9.5μLdH2O。PCR反应程序为：95℃预变性5min,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s，总扩增周期数为30。通过实时荧光定量PCR/TaqManPCR反应，对结果进行定量。
3.结果
3.1克隆与藤稔葡萄花发育相关的基因
我们使用RT-PCR克隆出10个与藤稔葡萄花发育相关的基因。这些基因分别命名为VvAG，VvAP1，VvSEP1，VvSEP2，VvSEP3，VvAP3，VvPI，VvAP2，VvLFY和VvSVP。
3.2序列分析和基因进化关系推断
对这些基因的序列进行分析和进化关系推断，可以发现它们的序列具有不同程度的保守性和异质性。通过系统进化树的构建，我们可以看到这些基因在进化过程中具有不同的亲缘关系。
3.3基因表达分析
我们使用RT-PCR测定在不同花发育阶段下，这些基因的表达模式。结果表明，这些基因在不同的花发育阶段中呈现出差异的表达模式。例如，VvAG和VvSVP在花芽期和幼花期表达较高，而在花瓣开放期表达下降；相反，VvSEP1在幼花期和花瓣开放期表达较高，而在其他发育阶段表达较低。
4.讨论
在本研究中，我们克隆了藤稔葡萄花发育相关的10个基因，并对其进行了序列分析和进化关系推断。而且，我们发现这些基因在不同的花发育阶段中呈现出差异的表达模式，表明它们在花发育中具有不同的作用。
研究结果表明，藤稔葡萄花发育过程中存在多个基因的协同调节。未来的研究可能将进一步探究这些基因在不同花发育阶段的调控机制，有助于为进一步优化葡萄生长提供理论基础。
5.结论
本研究克隆和表达分析了藤稔葡萄花发育相关基因。基于序列分析和表达差异，在不同花发育阶段下这些基因呈现不同的表达模式，表明它们在葡萄花发育中具有不同的功能，这为研究葡萄花发育的分子机制提供了重要的基础。