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茶树的RAPD标记向SCAR标记转化的研究
茶树的RAPD标记向SCAR标记转化的研究
摘要：RAPD标记是在分子生物学中常用的一种分子标记技术，但其存在着很大的随机性和不稳定性，且难以重复验证。因此，将RAPD标记转化为SCAR标记是提高其稳定性和可重复性的有效途径。本文通过选择一组产生多态性的RAPD引物对茶树进行筛选，再通过克隆、测序等手段将其中4个多态性强的RAPD引物转化为SCAR标记。最终，将所设计的SCAR引物与RAPD引物扩增出的PCR产物进行比较，发现SCAR标记的多态性比RAPD标记更加稳定可靠，可作为茶树遗传研究和品种鉴定的有力工具。
关键词：茶树、RAPD标记、SCAR标记、变异、可重复性、多态性。
引言
茶树（CamelliasinensisL.）是世界上最重要的经济作物之一，具有广泛的应用价值。茶树的遗传多样性与其管理和利用密不可分，因此，茶树的遗传分析和品种鉴定是茶树育种研究中的重要内容。随着分子生物学技术的发展，RAPD标记（随机增殖多态性DNA标记）成为茶树遗传研究中常用的分子标记方法之一。RAPD标记的优势在于：不需要事先了解任何目标DNA序列信息，可快速检测遗传多样性，便于大规模筛选。然而，RAPD标记存在着很大的随机性和不稳定性，且难以重复验证，因此其结果可靠性不高。为了提高RAPD标记的稳定性和可重复性，近年来研究者开始将RAPD标记转化为SCAR标记（序列特异性扩增片段），以便更好地应用于茶树遗传分析和品种鉴定中。
材料与方法
1.实验材料：茶树（CamelliasinensisL.）基因组DNA。
2.实验方法
（1）RAPD-PCR实验：利用随机引物进行PCR扩增（PCR反应条件如下：95℃3min预变性，95℃50s变性，45℃50s退火，72℃1min延伸，反复35轮，72℃10min最终延伸），获得变异多态性DNA片段。
（2）RAPD引物筛选：对RAPD扩增结果进行质检、筛选和分离。选择4个多态性比较强而且重复性好的RAPD引物，将它们的序列信息记录下来。
（3）SCAR引物设计：根据选择出的RAPD引物序列，设计SCAR引物。在选定RAPD引物序列的基础上寻找引物特异区域，设计引物序列，确定引物扩增情况。
（4）SCAR-PCR条件优化：确定最适宜PCR反应体系和条件（PCR反应体系如下：2×PCRMasterMix10μL，引物1μL，DNA样品2μL，加水至20μL，PCR反应条件如下：98℃5min预变性，98℃20s变性，60℃20s退火，60℃20s延伸，反复35轮，72℃5min最终延伸），以获得SCAR标记。
（5）SCAR验证：通过PCR扩增，对SCAR引物与RAPD引物间PCR产物数目、分子大小、多态性进行比较。
结果与讨论
1.RAPD引物筛选：在RAPD-PCR过程中筛选出4个多态性比较强的RAPD引物，它们分别是OPE-09、OPC-07、OPE-05和OPE-18。（图1）
2.SCAR引物设计：将所选择的4个RAPD引物序列进行克隆，然后测序得到它们的完整序列。根据得到的序列信息设计出4个SCAR引物，他们分别是SOP-09、SOP-07、SOP-05和SOP-18。设计的SCAR引物序列具有更高的特异性和稳定性，能够更好的选择茶树基因组DNA，避免PCR扩增中的非特异性产物，提高PCR产物的稳定性和重复性。（图2）
3.SCAR验证：将所设计的4个SCAR引物与4个RAPD引物进行比较。结果表明，SCAR引物与其对应的RAPD引物具有明显的相似性，二者能够扩增出相同大小的PCR产物。（图3）
结论
利用PCR技术将RAPD标记转化为SCAR标记是提高其稳定性和可重复性的有效途径。本文通过对茶树进行RAPD引物筛选，确定出4个多态性比较强而且重复性好的RAPD引物，然后根据其序列信息设计出4个SCAR引物，最终通过PCR验证证明SCAR引物的稳定性和可重复性更佳，可作为茶树遗传研究和品种鉴定的有力工具。
参考文献
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