细胞因子药物分析ppt课件.ppt

十五、生物技术药物分析1、概念：

2、分类｛2、重组DNA药物包括：
寡核苷酸药物：反义核酸等；
基因药物：腺病毒-IL-2、腺相关病毒-凝血Ⅸ因子；腺病毒-P53
细胞治疗制剂：抗原致敏的人树突状细胞
DNA疫苗：治疗乙型肝炎、爱滋病的核酸疫苗等。生物技术药物的质量控制与传统生产方法所得产品有本质的差别。可能会含有用传统生产方法不可能存在的有害杂质。例如在细菌中表达的产品可能有内毒素、致敏原，在动物细胞中表达的产品可能有DNA杂质和病毒。重组产品质量控制上存在的难点生物技术药物的质量控制生物技术药物的质量控制质量控制方法学研究具体内容一、鉴定1、氨基酸序列2、氨基酸组成3、N末端和C末端氨基酸测序4、肽图5、巯基和二硫键评价用生物技术方法生产的糖蛋白时，应考虑糖基化位点的上调或下调及其对生物活性、代谢、稳定性、溶解性的影响。
每一种真核细胞具有其独特的糖基化能力称为它的糖类型，通过基因工程方法将一种糖蛋白在不同细胞中表达，可以导致生产不同类型的糖蛋白，即使在相同的细胞类型中，也可能会出现糖形成时由于一些寡糖的精细结构不同等而产生截然不同的糖蛋白。对于糖蛋白，要测定糖含量(中性糖、氨基糖、唾液酸)。
另外，应尽可能分析多肽链的糖链结构、寡糖类型(触角形状)和糖基化位点。二、生物学活性测定和比活性有效的效价测定是生物技术原料药和/或制剂规范的组成部分。当原料药采用一种效价测定方法时，其制剂可用另一种方法(物理化学的和/或生物学的)测定。但应提供选择方法的依据。效价测定一般原则:
1、国际通用方法；
2、测定结果须用国际或国家标准品校正，以
国际单位表示。生物学活性测定方法分类利用动物体内某些指标变化，定出产品的单位，如EPO活性测定，体内注射EPO后，计算小鼠网织红细胞增加的数量与标准品比较，确定其活性单位。基于产品与某种物质的结合或产品本身的化学反应为原理设计，具有简便、精确、稳定等特点，如重组链激酶、葡激酶生物活性测定，链激酶、葡激酶和纤溶酶原（h-plg）结合形成复合物激活游离h-plg原为有活性的纤溶酶。利用制品免疫原性，制备相应单克隆抗体或多克隆抗体，采取ELISA法测定其含量。生物学活性测定方法选择生物学活性测定方法选择细胞培养法中细胞染色标记方法AlamarBlue：氧化型AlamarBlue（600nm）可被活细胞中的线粒体酶还原，还原后染料（570nm）发生颜色和荧光改变，颜色和荧光的深浅与活细胞数成正比，可用分光光度计或荧光检测仪检测。
Crystalviolet：染活细胞后，在比色计中测定光吸收值（A），A值与着染色细胞数成正比。
生物学活性测定分析方法蛋白质药物的比活性测定的意义生物活性测定标准范围确定不同生物活性测定方法的规定标准表
测定方法规定标准
动物基础的生物活性测定70%～130%标示量
细胞基础的生物活性测定80%～120%标示量
体外酶法的生物活性测定85%～115%标示量
受体结合的生物活性测定85%～115%标示量生物学活性效价测定过程中标准品的作用物理化学方法取代生物方法的条件三、蛋白质纯度检查由于生物技术产品及生物制品的分子特征和独特的生物合成过程，产品可含有几种分子实体或变异体。如这些分子实体来源于所预期的翻译后修饰品，则应作为预期产品的一部分。
预期产品在生产和/或储存过程中形成的变异体，如其性质与预期产品相似，应作为产品相关物质，而不是杂质。
对于批检验，只需选用一部分适用的方法并阐明其纯度测定的合理性。按WHO规定必须用HPLC和非还原SDS-PAGE两种方法测定，其纯度都应达到95%以上，有的甚至要求达到99%以上。
纯度的检查通常是在原液中进行。
方法：非还原SDS-PAGE电泳法、HPLC法、毛细管电泳。（1）非还原SDS-PAGE电泳法：
1）银染加样量≥5ug（1～10ng）
2）考马斯亮蓝R-250
加样量≥10ug（100ng）
结果：无明显杂蛋白带出现；目标蛋白量应不低于总蛋白量的95%或98%。蛋白质样品在荷质比均一。（2）HPLC法：分子筛、反相层析，离子交换层析，尽量采用与SDS-PAGE原理不同的反相或离子交换层析，不主张用分子筛分析。
（3）毛细管电泳：简便、快速、灵敏度和分辨率高；价格高、重现性差。
四、蛋白质含量测定可根据物理化学性质采用Folin-酚试剂法（Lowry法）、染色法（Bradford法）、双缩脲法、紫外吸收法、HPLC法和凯氏定氮等方法。Folin-酚试剂法：磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正相关。
灵敏范围：5～100ug/ml；
优点：简便、灵敏度较高；不同蛋白质间的变异少；
缺点：受多种物质干扰，反应速度慢，某些试剂不稳定。Br