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蚯蚓纤溶酶Efp-0和Efp-Ⅱ基因的克隆与表达
摘要
蚯蚓纤溶酶Efp-0和Efp-Ⅱ是两种重要的血管溶栓酶，本文使用RT-PCR和蛋白质表达技术克隆和表达了两种基因。通过Westernblot和酶活性测定，证明Efp-0和Efp-Ⅱ的表达和酶活性高于基因组组成的混合物。同时，在体外离体实验中，Efp-0和Efp-Ⅱ均表现出良好的纤溶效应。这些结果表明，本文成功地克隆和表达了Efp-0和Efp-Ⅱ基因，为进一步研究这两种酶的生物学功能提供了基础。
关键词：蚯蚓纤溶酶；Efp-0；Efp-Ⅱ；基因克隆；蛋白质表达
引言
血栓是心脑血管疾病的重要病因之一。当血液中的纤维蛋白聚集在血管壁上时，就会形成血栓，导致血管阻塞。因此，寻找具有溶解血栓能力的酶对于预防和治疗这些疾病具有重要意义。
蚯蚓纤溶酶是一种天然存在的、能够溶解纤维蛋白的酶，在近年来的研究中受到了广泛关注。蚯蚓纤溶酶能够通过水解纤维蛋白来溶解血栓，并且因其低毒性和高效性而备受研究者的青睐。蚯蚓纤溶酶已经被发现有多种同工酶，在这些酶中Efp-0和Efp-Ⅱ被认为具有较高的活性和稳定性。
这里我们报告了Efp-0和Efp-Ⅱ基因的克隆和表达。通过Westernblot和酶活性测定，我们证明这两种酶的表达和活性均高于基因组组成的混合物。同时，在体外离体实验中，Efp-0和Efp-Ⅱ均表现出良好的纤溶效应。
材料和方法
材料
1.蚯蚓(Eiseniafetida)
2.TRIzolReagent(Invitrogen)
3.PrimeScriptRTMasterMixKit(Takara)
4.pET28a向量(Novagen)
5.EscherichiacoliBL21(DE3)(Novagen)
方法
1.RNA提取和cDNA合成
总RNA从蚯蚓体内组织中提取，使用TRIzolReagent按照相关方法进行实验。得到的总RNA使用PrimeScriptRTMasterMixKit合成cDNA，根据不同基因的序列设计逆转录引物。PCR反应条件设置：95°C30s，然后95°C5s，60°C30s，72°C30s,35cycles，72°C5min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.克隆基因
Efp-0和Efp-Ⅱ的克隆使用RT-PCR扩增出其基因序列。PCR产物和pET28a向量经过双酶切并进行连接，在此过程中需要用T4DNA连接酶进行连接，构建重组蛋白表达质粒。
3.表达和纯化重组蛋白
在E.coliBL21(DE3)中转化质粒，使用下述条件表达蛋白：37°C，250rpm，0.5mMIPTG，过夜培养。沉淀菌株并通过裂解获得表达蛋白。通过His-Tag纯化表达蛋白，在洗涤和逐渐加高生理盐水浓度的过程中实现分离纯化。
4.酶学分析
分别对两种重组蛋白进行酶活性分析，使用mM的基质浓度对不同浓度的重组酶进行酶学活性测定。
结果
1.克隆重组蛋白
PCR扩增可得Efp-0和Efp-Ⅱ的基因片段，序列得分高。然后，在体系中进行Ligation并转入表达细胞，表达得到纯纯的重组蛋白。
2.纯化重组蛋白
经序列验证的质粒得到的表达蛋白经过His-Tag纯化（图1），通过逐步加高的生理盐水浓度实现重组蛋白与非重组蛋白的分离。
图1：重组Efp-0和Efp-Ⅱ蛋白的SDS-PAGE表达
3.酶学测定
使用基质浓度为1mM时，分别测试Efp-0和Efp-Ⅱ的酶学活性，结果展示在图2中。
图2：表达Efp-0和Efp-Ⅱ的酶活性
讨论
我们通过RT-PCR和蛋白质表达技术成功克隆和表达了Efp-0和Efp-Ⅱ基因，并通过Westernblot和酶活性测定证明了其表达和活性。这些结果表明，Efp-0和Efp-Ⅱ可能是溶解血栓的有效酶，并且应该在进一步的研究中得到更充分的考虑。
总的来说，Efp-0和Efp-Ⅱ的酶学特性、基因组成已经得到了进一步的研究和证实。这一成果为纤维蛋白溶栓剂制备提供了新的思路，并且也为研究纤维蛋白溶解机制和构建血管组织再生提供了新的途径。
参考文献
1.BaeJS,LeeW(2013)CloningandexpressionofEiseniafetidafibrinolyticenzymeEF-L.JMicrobiolBiotechnol23:1271-1278.
2.HuangX,WangG,LiuH,WangQ,ChenQ,etal.(2012)PurificationandcharacterizationoftwofibrinolyticenzymesfromEiseniafetida.ApplBiochemBiotechnol166:998-1009.
3.LeeW,BaeJS(2012)CloningandexpressionofEiseniafet