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褪黑素对Aβ25-35诱导原代脑皮层神经元损伤的保护作用及其机制研究
褪黑素对Aβ25-35诱导原代脑皮层神经元损伤的保护作用及其机制研究
摘要：
褪黑素是一种主要由松果体分泌的内源性激素，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种生理活性。本研究旨在探究褪黑素在Aβ25-35诱导原代脑皮层神经元损伤中的保护作用以及其机制。通过体外培养的原代脑皮层神经元细胞，使用MTT法、细胞凋亡检测等方法研究褪黑素对Aβ25-35诱导的神经元损伤的影响。结果表明，褪黑素处理组的细胞存活率显著高于Aβ25-35组，细胞凋亡水平也明显降低。进一步的机制研究表明，褪黑素处理组的ROS生成减少，线粒体膜电位（ΔΨm）维持较高水平，线粒体呼吸链复合物活性上调。同时，褪黑素还通过激活PI3K/AKT信号通路，促进细胞存活。本研究揭示了褪黑素在Aβ25-35诱导的神经元损伤中的保护作用及其潜在机制，为进一步探究褪黑素作为治疗神经退行性疾病的潜在药物提供了理论依据。
关键词：褪黑素；Aβ25-35；神经元损伤；保护作用；机制研究
1.引言
褪黑素，又称为褪黑激素，是一种由松果体分泌的内源性激素。褪黑素具有多种生理功能，包括抗氧化、抗炎、抗凋亡等。近年来的研究表明，褪黑素对神经系统具有保护作用，可减轻神经退行性疾病的病理过程。阿尔茨海默病（Alzheimer'sdisease，AD）是一种常见的神经退行性疾病，其发病机制尚不清楚。研究发现，β淀粉样蛋白（amyloid-beta）在AD中起着重要作用。Aβ蛋白主要存在于老年斑中，可导致神经元损伤和炎症反应。因此，探究褪黑素对Aβ蛋白诱导的神经元损伤的保护作用及其机制具有重要的生理和病理学意义。
2.实验方法
2.1原代神经元细胞培养
通过孵化器分离得到原代脑皮层神经元细胞，经过处理后，细胞悬浮液被以1370g离心10分钟，上清液抛弃，残余细胞悬浮液用2mL培养液重新悬浮均匀后分成不同组进行各自的处理。
2.2细胞存活率测定
采用MTT法测定细胞存活率。将细胞悬浮于96孔板中，加入Aβ25-35和/或褪黑素处理组。处理后，用MTT溶液培养细胞4h，DMSO溶解细胞沉淀，测定吸光度。
2.3细胞凋亡检测
使用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。细胞经过相应处理后，采用洗涤一次PBS的步骤，最后用AnnexinV-FITC和PI双染液处理30分钟，然后进行流式细胞仪测定。
2.4ROS检测
采用DCFH-DA染色法测定ROS生成。细胞处理后，添加DCFH-DA染色溶液处理30分钟，在流式细胞仪上测量细胞的荧光强度。
2.5线粒体膜电位（ΔΨm）测定
使用JC-1染色法测定线粒体膜电位。细胞处理后，添加JC-1染色溶液处理20分钟，在流式细胞仪上测量细胞的荧光强度。
2.6线粒体呼吸链复合物活性检测
采用酶活法测定线粒体呼吸链复合物活性。细胞经过处理后，提取线粒体蛋白，并进行相关酶活测定。
2.7PI3K/AKT信号通路检测
采用Westernblot法检测细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。
3.结果
3.1褪黑素保护神经元细胞免受Aβ25-35诱导的毒性作用
实验结果显示，褪黑素处理组的细胞存活率明显高于Aβ25-35组，表明褪黑素具有保护作用。
3.2褪黑素减少细胞凋亡水平
AnnexinV-FITC/PI双染法的结果显示，褪黑素处理组的细胞凋亡水平明显降低。
3.3褪黑素减少ROS生成，维持线粒体膜电位（ΔΨm）较高水平
DCFH-DA染色法的结果显示，褪黑素处理组的ROS生成明显减少。JC-1染色法的结果显示，褪黑素处理组的线粒体膜电位（ΔΨm）较高。
3.4褪黑素上调线粒体呼吸链复合物活性
酶活法的结果显示，褪黑素处理组的线粒体呼吸链复合物活性上调。
3.5褪黑素激活PI3K/AKT信号通路
Westernblot法的结果显示，褪黑素处理组的PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达明显上调。
4.讨论
本实验结果表明，褪黑素具有保护原代脑皮层神经元免受Aβ25-35诱导的损伤的作用。褪黑素通过多种途径发挥其保护作用，包括减少ROS生成，维持线粒体膜电位（ΔΨm）较高水平，上调线粒体呼吸链复合物活性等。此外，褪黑素还通过激活PI3K/AKT信号通路促进细胞存活。这些发现为进一步研究褪黑素作为治疗神经退行性疾病的潜在药物提供了重要的理论依据。
5.结论
褪黑素对Aβ25-35诱导原代脑皮层神经元损伤具有保护作用，其机制可能涉及多种途径，包括抗氧化、维持线粒体功能等。褪黑素还可通过激活PI3K/AKT信号通路促进细胞存活。这些发现有助于进一步研究褪黑素作为治疗神经退行性疾病的潜在药物。