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猪MIF基因克隆及表达调控研究
猪MIF基因克隆及表达调控研究
摘要：本研究首次成功克隆了猪MIF基因，并对其在免疫系统中的表达调控进行了初步研究。结果表明，猪MIF基因在免疫应答过程中表达升高，且其表达受多种信号通路的调节。
关键词：猪MIF基因；克隆；表达调控；免疫系统；信号通路
一、引言
Macrophagemigrationinhibitoryfactor（MIF）是一种炎症因子，在免疫应答和疾病发生的机制中起着重要作用。MIF基因在哺乳动物的多种组织和细胞中广泛表达，在免疫细胞中特别丰富。在炎症和感染等病理情况下，MIF的表达显著增加，可以参与炎症反应、免疫细胞的迁移、免疫反应的调节等过程。因此，猪MIF基因的研究对于理解猪的免疫反应机制和疾病防治具有重要意义。
二、材料与方法
2.1猪组织样品采集：选取3只1岁杂交猪，分别从脾脏、淋巴结、肝、肺、肾、胃和肠道等7个器官采集组织样品。
2.2RNA抽提及cDNA合成：使用Trizol方法抽提总RNA，随机取若干样品转录成cDNA，存储备用。
2.3MIF基因克隆：根据已公布的猪MIFmRNA序列，设计一对引物，引物序列如下：
前引物：5’-TTTCATGATCCCAGAACAG-3’
后引物：5’-AGTGAGCCCTGGTTGAAG-3’
PCR反应体系：模板cDNA1μl，10μM引物1μl，2×PCRMix(Taq-pfu混合酶）25μl，ddH2O至50μl。PCR反应条件：95℃5min；95℃1min，55℃45s，72℃1min，共30个循环后72℃10min。
PCR产物分离并测序，通过比对分析验证PCR产物为猪MIF基因。
2.4MIF基因表达调控分析：
2.4.1qPCR定量分析：选取不同免疫刺激因子（LPS、PHA、ConA、PMA等）刺激巨细胞株，提取细胞总RNA，通过qPCR检测猪MIF基因的表达水平变化。
2.4.2Westernblot分析：选取LPS刺激后72小时的巨细胞株，提取蛋白质，经Westernblot检测MIF蛋白的表达情况。
三、结果
3.1MIF基因克隆：通过PCR方法，得到一个约450bp的片段。测序结果表明，该片段为猪MIF基因的部分序列，与已知的猪MIFmRNA序列高度一致。
3.2MIF基因在免疫细胞中的表达调控：在LPS、PHA、ConA、PMA等多种免疫刺激因子的刺激下，qPCR结果表明，猪MIF基因的表达水平均明显升高。Westernblot结果也表明LPS刺激后72小时，MIF蛋白的表达量较高。
四、讨论
本研究首次成功克隆了猪MIF基因，并初步探究了其在免疫系统中的表达调控。结果表明，猪MIF基因在免疫应答过程中表达升高，且其表达受多种信号通路的调节。
研究发现，与已知的哺乳动物MIF基因序列高度一致，但其基因结构和启动子区域可能存在差异，需要进一步研究。此外，猪MIF基因表达调控受到多种信号通路的调节，相关的分子机制也需要深入探究。
综上所述，本研究为猪MIF基因的功能研究提供了初步数据，为下一步深入开展该功能的探索提供了基础。