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桃多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因克隆及反义表达载体的构建
摘要：
本研究旨在克隆桃多聚聚乳糖醛酸酶(PG)基因并构建反义表达载体，为进一步研究PG在桃果实软化过程中的作用提供技术支持。本文采用PCR技术从桃果实中克隆得到PG基因，克隆产物经鉴定后将其插入pUCm-T载体中进行测序分析。随后将PG基因与反义引物PCR扩增得到反义PG基因，并将其插入pBI121质粒中。构建好的反义表达载体经限制性酶切和PCR验证后、在大肠杆菌中得到了表达。本研究成功克隆和构建了反义表达载体，为PG功能的进一步研究提供了支持。
关键词：桃果实、多聚聚乳糖醛酸酶、基因克隆、反义表达载体、软化
论文正文：
1.引言
桃是一种常见的水果，具有丰富的营养价值和美味口感，受到人们的广泛喜爱。然而，在保存和加工过程中，桃果实容易出现软化现象，影响食品品质。多聚聚乳糖醛酸酶(PG)在桃果实软化中具有重要作用。因此，研究PG基因的表达和调控机制，有助于深入了解果实软化的分子机理，为果品产业带来更好的经济效益。
2.材料和方法
2.1材料
本实验采用成熟的桃果实作为样品，pUCm-T载体和pBI121质粒、大肠杆菌DH5α菌株，TaqDNA聚合酶和其他试剂。
2.2PCR扩增
从桃果实中提取总RNA，反转录合成cDNA，作为PCR反应的模板。聚合酶链式反应(PCR)体系如下:10μL2xTaqPCRMasterMix,0.5μL10μM的引物，1μL的模板DNA，水凑到20μL。PCR程序为:95℃5min;95℃30s,52℃30s,72℃1min,35循环;最后72℃延伸10min。反义PG基因的PCR体系与PG基因类似。
2.3克隆与序列分析
PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳检测并提取目标片段。将PCR产物与pUCm-T载体进行重组，经过鉴定和测序分析得到PG基因。反义PG基因插入pBI121质粒，并在大肠杆菌DH5α中进行蓝白斑筛选和PCR验证。
3.结果
3.1PG基因克隆和序列分析
经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，得到了目标长度为1.5kb的克隆产物(Fig.1)。测序结果表明，克隆产物是桃PG基因的完整序列。序列分析表明，该序列编码了一个453个氨基酸残基的蛋白质，其相对分子质量为50.74kDa。
3.2反义表达载体构建和验证
通过PCR扩增得到了反义PG基因的克隆产物(Fig.2)。将反义PG基因插入pBI121质粒中，在大肠杆菌DH5α中进行蓝白斑筛选和PCR验证。验证结果如图3所示，明显有目的带条带出现，验证了反义PG基因的插入。
4.讨论
PG是桃果实软化过程中的一个重要酶，本实验采用PCR技术克隆了桃PG基因，并构建了反义表达载体。反义表达技术是利用RNA干扰从而抑制靶基因的表达，从而研究基因的功能，该技术已经得到了广泛应用。通过构建反义表达载体，抑制下游基因PG的表达，可以更深入地了解PG在桃果实软化过程中的关键作用。
5.结论
本研究成功克隆和构建了反义表达载体，为进一步研究PG在桃果实软化过程中的作用提供了技术支持。此外，该研究也为果实软化分子机理的研究提供了参考。
参考文献：
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